黄芩提取物局部治疗实验性牙周炎的研究

    滕蕊 郭宁 赵晓丹 刘瑾 李昂 苟建重

    

    

    

    [摘要]目的：建立SD大鼠實验性牙周炎动物模型，观察黄芩提取物对其IL-1β和牙槽骨骨密度等的影响。方法：建模组（牙周炎组和黄芩提取物组）在大鼠上颌第二磨牙腭侧局部注射牙龈卟啉单胞菌液（P.g.W83），丝线结扎牙颈部，再局部涂抹菌液，饲以软食;8周后采用50mg/L黄芩提取物局部给予药物治疗，4周后检测龈沟液和唾液中的IL-1β含量及牙槽骨骨密度等变化。结果：8周后建模组大鼠双侧上颌第二磨牙腭侧牙龈组织红肿，易出血，牙周袋约3～4mm;龈沟液和唾液中IL-1β明显升高;Micro CT显示牙槽骨吸收达根1/2处，根分叉区可见牙槽骨吸收低密度投射区，牙周炎模型建立成功;50mg/L黄芩提取物治疗4周后，龈沟液和唾液中的IL-1β明显下降，牙槽骨密度、高度等显著升高。 结论：该方法能够快速、稳定、有效地建立SD大鼠实验性牙周炎模型，50mg/L黄芩提取物能明显改善大鼠牙周炎组织中IL-1β和牙槽骨状况，为牙周病的临床防治提供实验依据。

    [关键词]牙龈卟啉单胞菌;SD大鼠;实验性牙周炎;黄芩提取物;白细胞介素1β;牙槽骨

    [中图分类号]R781.4+2? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2020）10-0115-04

    The Study on Local Treatment of Experimental Periodontitis Using

    Scutellaria Baicalensis Extracts

    TENG Rui1， GUO Ning2， ZHAO Xiao-dan2， LIU Jin2， LI Ang2， GOU Jian-zhong2

    （1.Department of Stomatology， Xi 'an Jiaotong University Hospital， Xian 710049，Shaanxi，China; 2.Periodontal Department of Stomatological Hospital of Xi'an Jiaotong University， Xian 710004 ，Shaanxi，China）

    Abstract： Objective? To establish an experimental periodontitis model in SD rats rapidly， and determine the effects of Scutellariabaicalensis extracts on IL-1βand alveolar bone in SD rats. Methods? After ligated the cervical region using wire ligatures， the male SD rats in experimental group were received a direct injection of P.g.W83 into the palatal gingival tissue of the bilateral maxillary second molar. Then the P.g.W83 bacterial solution were applied locally and feed with soft food 8 weeks. The content of IL-1 β in gingival crevicular fluid and saliva and the density of alveolar bone were measured after 4 weeks using 50mg/L Scutellariabaicalensis extracts. Results? 8 weeks later， the gingival of SD rats in experimental group were red and swollen， bleeding on probe and probing depth was about 3-4mm.The levels of IL-1β both in gingivalcrevicular fluid and saliva were higher than control. The micro CT demonstrated the level of alveolar bone was destroyed to the half of teeth root of the second molar tooth. Alveolar bone resorption can be seen in the root bifurcated area and buccolingual sections.Theseindicated that the periodontitis model in SD rats was established successfully. After 4 weeks of treatment with 50mg/L Scutellariabaicalensis extract， the level of IL-1β in decreased significantly， and the density and height of alveolar bone increased significantly. Conclusion? This method can be used to establish an experimental periodontal in SD rats rapidly， and 50 mg/L Scutellariabaicalensis extract can significantly decrease the level of IL-1β and improve alveolar bone in periodontitis.It can provide a basis for further study on etiology，prevention and treatment of periodontitis.

    Key words： Porphyromanusgingivalis（P.g.）;SD rats;experimental periodontitis;Scutellariabaicalensis extracts;IL-1β;alveolar bone

    牙周病作为一种口腔常见病和多发病，是由细菌感染引起的慢性炎症性疾病，随病变发展会导致牙周支持组织（牙龈、牙周膜、牙骨质及牙槽骨）的持续性破坏，最终引起成年人牙齿丧失[1]。建立牙周病的动物实验模型，对于了解其病因、起源、病理发展、诊断，以及采用新型生物材料和药物防治牙周病至关重要，一直是口腔科学的研究重点之一[2-3]。目前，SD大鼠是建立牙周炎模型的主要动物[4-5]。黄芩提取物可缓解牙龈卟啉单胞菌膜泡抑制牙周膜成纤维细胞碱性磷酸酶活性，刺激细胞成骨转化，利于病变愈合[6];还可降低牙周膜细胞表面RANKL/OPG比值，引起RANKL诱导的破骨细胞数量减少，炎性因子下降，从而使牙槽骨丧失减缓或停止，最终减轻牙周炎症[7-8]。本研究拟采用牙龈卟啉单胞菌和结扎丝联用的方法，同时饲以软食，快速、简便、稳定地建立SD大鼠的实验性牙周炎动物模型，再采用50mg/L黄芩提取物局部治理，研究龈沟液、唾液中IL-1β含量和牙槽骨的变化，探讨黄芩提取物对牙周炎大鼠炎症和骨代谢的影响，为临床进一步运用其作为新的牙周炎治疗药物奠定基础。

    1? 材料和方法

    1.1 动物选择和分组：60只SD大鼠，清洁级，雄性，牙列完整，无龋坏及牙周病，体重（170±10）g（由西安交通大学医学部动物实验中心提供）。随机分其中的40只大鼠为建模组，20只大鼠为对照组;待建模成功后，将建模组大鼠随机再分为两组：牙周炎组和黄芩提取物治疗组，每组20只大鼠。

    1.2 牙龈卟啉单胞菌P.g W83菌液制备：牙龈卟啉单胞菌（Porphyromanusgingivalis， P.gW83），购于首都医科大学，由空军军医大学微生物实验室培养。将1×107的P.g W83细菌溶于1ml的无菌PBS中，混匀，即得注射用菌液;取上述注射用菌液0.5ml与等量PBS液混匀，即得涂抹用菌液。

    1.3 实验试剂：黄芩提取物购自陕西飞达生物有限公司（质控指标黄芩素含量80%），使用时用灭菌水制成50mg/L的溶液进行局部注射，水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司），IL-1β酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（R&D）。

    1.4 实验方法

    1.4.1 建立SD大鼠实验性牙周炎模型：在500ml灭菌水中加入复方新诺明混悬液10ml，代替所有大鼠日常饮水进行抗生素预处理1周，再换回正常饮水1周。建模组：1%戊巴比妥钠按照5ml/kg体重进行腹腔麻醉后，开口器撑开口角（见图1A）在双侧上颌第二磨牙（见图1B）腭侧牙龈沟底注射菌液20μl（见图1C），并使用结扎丝线结扎牙颈部（见图1D），颊侧打结，并尽量压入牙龈沟内，然后于结扎丝线涂抹100μl菌液。每隔2天重复一次，共4次;对照组：腹腔麻醉后，在双侧上颌第二磨牙腭侧牙龈沟底注射20μl无菌PBS，并涂100μl的PBS溶液，每隔2天重复1次，共4次。建模期间，所有大鼠均饲以软食。

    之后每隔2周，检查丝线脱落情况，若丝线脱落再行结扎，未脱落者进一步压向牙龈沟底，同时观察两组大鼠的牙周情况。

    注：A.开口器撑开SD大鼠口腔;B.上颌第二磨牙;C.第二磨牙腭侧牙龈沟底注射菌液;D.结扎丝结扎上颌第二磨牙牙颈部

    1.4.2 药物治疗SD大鼠牙周炎：按照前述实验分组，待8周后建模成功，建模组SD大鼠均去除牙颈部结扎丝，黄芩提取物药物治疗组于双侧上颌第二磨牙腭侧牙龈沟底注射50mg/L药液50μl，牙周炎组注射等量PBS溶液，每隔1天注射1次，一共4次;对照组不进行特殊处理。所有实验大鼠继续喂饲软食。

    1.4.3 样本采集：建模8周和黄芩提取物药物治疗4周后，使用滤纸条采集大鼠建模牙齿腭侧的龈沟液，唾液（见图2），标本均于-70℃保存。

    注：A.采用滤纸条法取SD大鼠龈沟液;B.采用滤纸条法取SD大鼠唾液

    检测前将取龈沟液和唾液的所有滤纸条剪碎后加入1ml的PBS（0.01mol/L，pH值7.4）进行充分匀浆，然后离心（转速为3 000rpm）取上清液待检。按照ELISA检测试剂盒说明书步骤进行操作，根据标准曲线计算出唾液及龈沟液中的IL-1β含量。

    1.4.4 影像学检查：建模8周后建模组和对照组各处死部分SD大鼠，药物治疗4周后处死全部大鼠，取双侧上颌骨置于10%福尔马林中进行固定，漂洗并去除软组织，保留硬组织，将样本置于Micro-CT系统的检测试管内，540°扫描（扫描分辨率10.44μm×10.44μm），最后使用Cobra软件进行三维重建，观察各组大鼠牙槽骨吸收情况。同时使用VIVID软件，分析牙槽骨各项参数，包括相对骨体积（BV/TV），骨表面积体积比（BSA/BV），骨小梁厚度（Tb·Th），骨小梁数目（Tb·N），骨小梁间隙（Tb·Sp），骨小梁模型因子（Tb·Pf）。

    1.5 统计学分析：将实验所得数据通过SPSS 20.0进行数据分析，实验结果以x?±s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

    2? 结果

    2.1 建模8周后SD大鼠大体观察：8周后，建模组大鼠皮毛无光泽、进食减少、活动笨拙，双侧上颌第二磨牙腭侧牙龈组织红肿，易出血，牙周袋约3～4mm（见图3A～B）;对照组大鼠毛泽光亮，饮食饮水正常，活动正常，双侧上颌第二磨牙腭侧牙龈組织无红肿，无出血，无牙周袋（见图3C）。

    注：A.建模组，龈沟出血指数（SBI）=4;B.建模组，牙周探诊深度约2mm;C.对照组，牙龈色、形、质正常

    2.2 建模8周后SD大鼠龈沟液和唾液中IL-1β含量：建模8周后，龈沟液和唾液中的IL-1β通过ELISA试剂盒检测后结果见表1。建模组龈沟液和唾液中的IL-1β明显高于对照组，有统计学意义（P<0.01），且龈沟液中的差异大于唾液（P<0.05）。

    2.3 建模8周后SD大鼠颌骨组织Micro CT检查结果：Micro CT图像可见，实验组双侧上颌第二磨牙牙槽骨吸收达根中1/2处，根分叉区可见低密度投射区，且二维的近远中向和颊舌向断面也可见牙槽骨吸收的低密度暗影（红色箭头所指区域）（见图4A～D）;对照组双侧上颌第二磨牙牙槽骨高度正常，根分叉区和二维的的近远中向和颊舌向断面均见骨高度和骨密度无明显异常（红色箭头所指区域）（见图5A～D）。

    2.4 黄芩提取物局部治疗4周后SD大鼠龈沟液和唾液中IL-1β含量：采用50mg/L黄芩提取物局部治疗4周后，龈沟液和唾液中的IL-1β含量见表2。药物治疗组的龈沟液和唾液中IL-1β明显下降，和牙周炎组比较有统计学意义（P<0.05），和对照组比较差异无统计学意义。

    2.5 黄芩提取物局部治疗4周后SD大鼠牙槽骨变化：采用50mg/L黄芩提取物局部治疗4周后，SD大鼠牙槽骨组织的骨参数分析见表3，相对于建模后未进行治疗的牙周炎组，经过药物治疗组的各组参数均有显著的变化：相对骨体积（BV/TV），骨表面积体积比（BSA/BV），骨小梁厚度（Tb·Th），骨小梁数目（Tb·N），骨小梁间隙（Tb·Sp）比牙周炎组升高，而骨小梁模型因子（Tb·Pf）比牙周炎组下降，差异有统计学意义（P<0.05）;和对照组比较，相对骨体积、骨小梁厚度及骨小梁模型也有统计学差异（P<0.05）。

    3? 讨论

    实验性牙周炎动物模型的建立方法有很多种[5，9-10]，1964年，Keyes等利用高湯低蛋白饲料（Keyes 2000）就成功诱导地鼠典型的牙周炎症状，有学者利用丝线结扎动物牙颈部造成菌斑滞留也是较为常用的建模方法，接种牙周可疑致病菌也是较为常用的建立牙周炎动物模型的方法。目前，已有多种方法将可疑的牙周病原菌成功接种于实验动物口腔内[11-12]。将108～109浓度的牙周可疑致病菌接种于口腔2～3次，有或无丝线结扎可用于牙周炎模型构建[13];另有学者使用浸有P.g的线结扎牙颈部，也可以建立有效的牙周炎模型，能使牙槽骨破坏位点特异化;并且证明至少105的P.g.W83就很容易定植在大鼠的牙龈沟内，在一次细菌接种后15周仍有58%的细菌检出率，且细菌感染组在感染后的13～15周观察到了非常明显的牙槽骨丧失量[14]。

    上述各种方法均是诱导动物的实验性牙周炎模型的方法，但是存在实验时间长、不稳定的问题，因此，本研究将以上方法联合应用，采用同时接种牙周致病菌P.g W83+丝线结扎牙颈部+喂饲软食，8周后通过口腔检查情况，龈沟液和唾液中炎性因子IL-1β的含量，牙槽骨变化等说明，此方法可快速、稳定构建无缺陷SD大鼠的实验性牙周炎模型。

    牙周炎是一种慢性炎症性疾病，牙周炎症期间可以产生许多细胞因子。其中IL-1β是参与牙周炎骨破坏作用最经典的细胞因子，它在牙周炎的进展中发挥着重要作用，很多研究均证实，IL-1β水平在牙周炎症部位较健康组织显著升高，经过治疗后其水平明显下降，因此可作为牙周炎的诊断指标之一[15-16]。在本研究中，同时收集了实验大鼠的龈沟液和唾液，通过酶联免疫吸附ELISA实验测定IL-1β的含量。结果显示，建模后的龈沟液（P<0.01）和唾液（P<0.05）中的IL-1β水平有显著上升，经过黄芩提取物的药物治疗后，相对于建模的牙周炎组，其含量均明显下降，说明药物治疗4周后就可以明显改善牙周炎的炎症症状。

    牙周炎的症状主要包括牙龈炎症、牙周袋的形成、牙槽骨丧失及牙齿的松动甚至脱落。在本研究中，实验组观察到了明显的牙龈炎症，牙周袋的深度约3～4mm。Micro CT 检测了牙槽骨的丧失情况，在上颌第二磨牙的腭侧和根分叉区观察到了明显的牙槽骨丧失影像。尽管同时笔者观察到了第一磨牙和第三磨牙也见有牙槽骨吸收，但第二磨牙因有局部注射菌液、结扎丝线和涂抹在丝线表面的活菌，以及黏附在丝线上的软食，其牙槽骨的吸收程度更严重。通过Micro CT测量骨小梁指标时一般采用三维参数计量，其中相对骨体积（BV/TV），骨表面积体积比（BSA/BV），骨小梁厚度（Tb·Th），骨小梁数目（Tb·N），骨小梁间隙（Tb·Sp）数值越大说明骨的健康状况越好;而骨小梁模型因子（Tb·Pf）是表示骨小梁连续性的参数，其值越小表示骨小梁的连续性越好。表3的骨参数分析表明，相对于建模后的牙周炎组，经过黄芩提取物治疗的各组参数均有显著的变化（P <0.05），说明此药物具有一定的促成骨作用，可以用于牙周骨组织再生;同时和对照组相比较，相对骨体积、骨小梁厚度及骨小梁模型这几个参数也有统计学差异，说明药物治疗组的骨组织尚未达到完全的恢复，这可能和药物作用时间较短（只有4周）有关系，在后续实验中笔者会延长药物治疗时间和观察时间，希望取得更好的促进牙周骨组织再生的效果。

    本研究快速、稳定、有效地建立SD大鼠的实验性牙周炎模型，模拟牙周炎发展进程;采用50mg/L黄芩提取物局部治疗4周后，龈沟液、唾液中炎性因子IL-1β含量明显下降，牙槽骨有一定程度的恢复，说明黄芩提取物可改善大鼠牙周炎的炎症状况，促进骨代谢，为临床进一步运用其作为新的牙周炎治疗药物奠定基础。

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    [收稿日期]2020-01-09

    本文引用格式：滕蕊，郭宁，赵晓丹，等.黄芩提取物局部治疗实验性牙周炎的研究[J].中国美容医学，2020，29（10）：115-119.