应用丙酸氯倍他索乳膏建立兔激素依赖性皮炎模型及其皮肤病理变化观察
朱睿 陈茜 徐瑞雪 杨文佳 陈洪铎 徐天华
[关键词]激素依赖性皮炎;兔模型;丙酸氯倍他索乳膏;病理变化
近些年来激素依赖性皮炎的患病率逐年增加，这可能与激素的不正当使用及应用含有激素的护肤、美容产品有关[1]。临床表现为皮肤干燥、脱屑、瘙痒、片状红斑、萎缩和对外界刺激敏感等症状。但是目前因为伦理问题具体皮肤病理表现尚未明确。本实验通过应用丙酸氯倍他索乳膏建立兔激素依赖性皮炎模型模拟临床激素依赖性皮炎发生发展过程，动态观察该疾病的病理变化，为今后治疗提供理论基础及治疗思路。
1 材料和方法
1.1 材料：12只成年健康雄性新西兰大白兔（沈阳宝利恒生物技术有限公司），0.02%丙酸氯倍他索乳膏（广东华润顺峰药业有限公司），本实验通过中国医科大学伦理委员会审批。
1.2 方法：12只白兔每只背部用动物剃毛器机械剃毛5cm×8cm大小范围，充分暴露其皮肤，暴露部位皮肤每日1次外涂1/2指尖单位0.02%丙酸氯倍他索乳膏（恩肤霜）连续80d，于兔背毛再次生长后继续机械剃毛至不再生长。造模开始每5d应用数码相机拍照，观察造模皮肤外观变化。取造模前及造模后第20、35、50、65及80天各时间点的皮肤组织进行病理活检，活检组织置于4%甲醛中固定，石蜡包埋，常规切片做苏木素-伊红染色（HE）在普通光镜200倍镜下观察表皮厚度变化，天狼猩红染色在普通光镜200倍及偏振光镜400倍镜下观察真皮中胶原纤维变化。
1.3 统计学分析：本研究采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料采用（x?±s）进行描述，方差分析进行比较。检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 主观外观变化：外用0.02%丙酸氯倍他索乳膏第20天可见造模处皮肤潮红;第35天皮肤潮红加重、干燥、可见丘疹及小脓疱，无毛发生长;第50天可见皮肤干燥，片状红斑，皮肤干燥附有少量鳞屑;第65天外观可见片状红斑、皮肤明显变薄、皮下可见毛细血管，表面干燥脱屑，停药2d皮肤潮红、干燥较前更加明显，继续用药后可缓解，呈现激素依赖性皮炎症状。第80天背部皮肤明显变薄，皮下毛细血管清晰可见，上附有少许鳞屑，第80天后有4只兔死亡，见图1。
2.2 皮肤病理变化
2.2.1 表皮：HE染色镜下观察表皮厚度变化：第20天表皮较正常比较增厚，差异有统计学意义（P <0.05）;第35天表皮厚度较正常比较增厚，薄厚略有不均，差異有统计学意义（P <0.05）;第50天表皮厚度较正常比较明显增厚，薄厚明显不均（P <0.05）;第65天较正常比较表皮厚度下降、与第50天比较下降明显，薄厚不均程度较前减轻，差异有统计学意义（P <0.05）;第80天表皮厚度较正常比较下降，差异有统计学意义（P <0.05）;但与第65天比较无明显差异，表皮厚度趋于均匀，结果见图2～3。
2.2.2 真皮：天狼猩红染色普通显微镜200倍镜下显示，正常真皮中的胶原纤维含量较多，偏振光镜400倍镜下显示真皮内Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维较粗、排列规则、致密;第20天普通光镜下真皮中胶原含量较正常皮肤无明显差异，偏振光镜下Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维较正常皮肤变得略纤细、排列稍紊乱;第35天普通光镜下真皮中胶原纤维含量较正常减少，差异有统计学意义，偏振光镜下Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维变纤细、排列松散、扭曲;第50天普通光镜下真皮中胶原纤维含量较正常明显减少，差异显著，偏振光镜下Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维变得更加纤细、凌乱;第65天普通光镜下真皮中胶原纤维较正常明显减少，差异显著，偏振光镜下Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维纤细、排列紊乱，出现断裂;第80天普通光镜下真皮中胶原纤维含量较正常明显减少，差异显著，但与第65d比较无差异，偏振光镜下Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维更加纤细、排列紊乱、扭曲、断裂，见图4～5。通过统计分析真皮内胶原纤维含量随外用激素时间延长而逐渐减少，见图6。主观外观及客观病理变化均证实激素依赖性皮炎造模成功。
3 讨论
目前人们生活水平的提高，对面部美容要求日益提高，从而出现越来越多应用护肤品引起面部皮炎的案例，国内把长期应用含激素或含有激素的护肤品引起的皮炎暂称为激素依赖性皮炎，虽然目前国际尚无统一命名，但临床表现公认为皮肤干燥、脱屑、瘙痒、对外界刺激敏感，片状红斑和皮肤萎缩等症状[2]。该病发病机制也尚未明确，目前主要认可的发病机制考虑为皮肤屏障功能损伤[3]。
国外学者Ludger Kolbe等[4]曾用非入侵的方法研究论证激素依赖性皮炎皮肤变化主要为皮肤萎缩而引起屏障功能损伤，屏障功能受损会增加皮肤的渗透性，进而增加药物的吸收，引起炎症因子增加和微生物侵袭破坏皮肤功能。国外学者Schilling等[5]也得出与上述相同推论，他们通过临床治疗并观察玫瑰痤疮患者发现皮肤屏障的损伤可加重毛细血管的扩张，引起炎症因子增加，造成恶性循环。
因伦理原因，不能人体实验取材观察，为了验证激素依赖性皮炎发病过程和可能的机制，本实验以新西兰白兔为动物模型，和以往学者应用香猪、豚鼠、小鼠等动物制作该疾病模型[6]比较更经济实用，易实验操作，是更为适合造模的实验对象。
既往制作激素依赖性皮炎动物模型外涂药物多选用酊剂，因其内不含有基质成分[7]，减少基质对皮肤非特异性增生影响，从而缩短造模时间。而临床中激素依赖性皮炎患者的病因多是因为应用了含有基质的激素类乳膏或护肤品导致，所以应用含激素的酊剂外涂造模并不能有效的反映临床激素依赖性皮炎的实际病理变化，因此本实验应用丙酸氯倍他索乳膏为造模药物。丙酸氯倍他索乳膏为成品膏剂，内含有一些基质成分，乳膏中基质成分一般含硬脂酸、液状石蜡、羊毛脂、白凡士林、三乙醇胺等[8]。该乳膏制作动物模型虽然较外涂酊剂时间长，但更能有效模拟临床激素依赖性皮炎的实际病理形成过程及可能的发病机制。
外用0.02%丙酸氯倍他索乳膏第20天可见造模处皮肤潮红;第35天皮肤潮红加重、干燥、可见丘疹及小脓疱，外观无毛发生长;第50天可见皮肤干燥，片状红斑，皮肤干燥附有少量鳞屑;第65天外观可见片状红斑、皮肤明显变薄、皮下可见毛细血管，表面干燥脱屑，停药2d皮肤潮红、干燥较前更加明显，继续用药后可缓解，呈现激素依赖性皮炎症状。研究表明激素依赖性皮炎，表皮变化并不一定是持续变薄，可能由于基质的因素会存在过敏、非特异性炎性增生期，但随时间的延长，表皮开始逐渐变薄，所以表皮变薄是激素依赖性皮炎一特征性病理变化[9]。正常真皮中的Ⅰ型胶原为主要成分，约占80%以上，其次为Ⅲ型胶原纤维比例约占10%～15%，Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维为真皮中基质的主要成分[ 1 0 ]。造模第20天至第50天模型出现表皮非特异性增生的过程，在第50天表皮厚度达高峰，但第50天真皮中胶原纤维较正常状况下却明显减少;第65天表皮厚度较正常下降，较第50天厚度明显降低，真皮中胶原纤维也继续明显减少，真皮中Ⅰ型及Ⅲ型胶原纤维随激素应用时间的延长而逐渐变得纤细、扭曲、甚至断裂。这些实验结果均与前面的研究相一致，所以进一步证实激素依赖性皮炎病理表现主要为表皮的变薄，真皮胶原纤维的减少、破坏而导致皮肤屏障功能损伤。因造模第80天与第65天表皮及真皮差异均不明显，且有4只兔外涂激素到80d，出现感染症状，最终死亡，考虑可能涂抹面积相对较大，随时间延长导致机体吸收激素过多，引起机体不良反应而死亡，所以结合造模第65天模型的外观和病理特点造模已成功。
以上研究结果给今后用丙酸氯倍他索乳膏建立兔激素依赖性皮炎动物模型推荐了造模时间及外观表现的数据，能成功模拟临床激素依赖性皮炎疾病的病理变化及发展过程，为进一步临床诊治，如观察药物治疗、激光和强脉冲光治疗[11-12]等提供研究模型。
