微小RNA对颅颌面骨改建调控的研究进展
王一轩?孙智雯?麦志辉
【摘要】微小RNA（miRNA）在颅颌面骨缺损修复的调控中起重要作用。近年来多项研究表明miRNA可以通过直接或间接作用参与骨的修复与改建。机械力刺激、通路调节、炎性因子等多种因素使miRNA在颅颌面骨改建中的调控复杂多样。该文概述了miRNA在颅颌面骨改建中的作用机制，并从机械力刺激、通路调节及炎性因子3个方面对其在颅颌面骨改建过程中的调控进行综述。
【关键词】微小RNA;骨改建;颅颌面骨;机械力学;通路调节;炎性因子
Research progress on the role of microRNA in regulating cranio-maxillofacial bone remodeling Wang Yixuan， Sun Zhiwen， Mai Zhihui. Department of Orthodontics， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen Uni- versity， Guangzhou 510630， China
Corresponding author， Mai Zhihui， E-mail： maiya2007@ 126. com
【Abstract】MicroRNA （miRNA） plays an important role in regulating the repairing of cranio-maxillofacial bone defects. Recent studies have shown that miRNAs participate in bone repairing and remodeling through direct or indirect effect. Mechanical force， pathway regulation， inflammatory cytokines and other factors enhance the complexity and diversity of the regulation of miRNA cranio-maxillofacial bone remodeling. In this article， the mechanism underlying the role miRNA in cranio-maxillofacial bone remodeling was summarized， and its regulation in cranio-maxillofacial bone remodeling was reviewed from three aspects of mechanical stimulation， pathway regulation and inflammatory cytokines.
【Key words】MicroRNA;Bone remodeling;Cranio-maxillofacial bone;Mechanical force;
Pathway regulation;Inflammatory cytokine
《中國卫生和健康统计年鉴2019》显示，2018年我国骨类疾病相关的门诊治疗人次达1569.24万人次，相比2013年总诊疗人次增加了300多万。而2018年公立医院出院病人中仅颅颌面骨骨折出院的患者数量就高达168 449人次，占同年因骨折出院人数的27.75%[1]。虽然骨缺损修复的需求逐年增加，且已发现多种影响骨改建的因素，但颅颌面骨缺损修复的相关机制仍未完全阐明[2-4]。
近年来，微小RNA（miRNA）在骨改建调控领域中展现出巨大的研究价值。miRNA是经过Diecer酶加工后的终末产物。它从初级转录产物miRNA （pri-miRNA）通过形态学的改变，并被Diecer酶剪裁后形成成熟的非编码小RNA分子。尽管miRNA调控骨改建的作用机制尚未明晰，但已有多项研究表明miRNA可以促进骨缺损修复[5-8]。本文主要从机械力刺激、通路调节以及炎症因子3个方面对miRNA在颅颌面骨改建中的调控展开综述。
一、miRNA在颅颌面骨改建调控中的作用机制
miRNA在细胞增殖、分化和凋亡等多种生命活动中发挥重要调控作用，因此它在研究真核生物的基因表达和功能调控中有重要意义。研究显示miRNA的作用部位在其种子序列上5端第2 ～ 8位核苷酸，它识别目标基因mRNA上3端的结合位点，并携带RNA蛋白复合物与mRNA结合。miRNA的作用机制包括与靶基因部分结合以抑制靶基因翻译，和靶基因完全结合切断靶基因的mRNA使其降解，或结合以上两种情况，通过与mRNA完全或部分碱基互补配对，降解或抑制翻译，达到干扰靶基因翻译和表达的作用[5]。
颅颌面骨是支持性结缔组织，具有一定的硬度和弹性。颅颌面骨组织在生长发育及损伤修复等刺激下，骨性微环境发生改变，在各种因素调控下产生成骨细胞和破骨细胞的动态变化，从而达到新的微环境平衡。
miRNA在颅颌面骨改建的调控作用主要存在于骨代谢中各细胞因子的增殖分化。颅颌面骨在骨发育和骨代谢中，根据各部分组织来源不同（如额骨来源于神经嵴，顶骨来源于中胚层），miRNA的分布也不同，其不仅参与骨重塑，而且通过影响成骨或破骨细胞等的增殖、分化和凋亡进一步调控骨改建[9]。由于骨细胞具有应力感知及信号传递的枢纽作用，在细胞内外微环境改变时，不同miRNA参与调控骨细胞信号传递的效果不同，因此，miRNA在骨骼系统的调控通常是多因素、多通路的。
二、影响miRNA在颅颌面骨改建调控的相关因素
1.机械力刺激
骨组织改建的始动因素之一是机械力刺激。适当的机械力刺激可以调控骨改建以维持骨骼内矿物质的合理比重，而不当的机械力刺激，则可造成骨吸收，细胞异常增殖等。
不同miRNA有不同的生物学特性，有的miRNA具有机械力敏感性。Wu等[10]通过对牙周膜细胞（PDLC）的体外力学加载模型进行高通量测序，得出拉伸状态PDLC的miRNA表达谱。他们通过生物信息学分析发现，在拉伸和非拉伸不同的外力刺激状态下，PDLC中共有47个miRNA出现差异表达，并检测出9种与骨改建相关的miRNA（miR-221-3p、miR-138-5p、miR-132-3p、miR-218-5p、miR-133a-3p、miR-145-3p、miR-143-5p、miR-486-3p和miR-21-3p）。
在机械力作用下，miRNA可通过调控细胞的增殖、分化和凋亡进而调控骨改建。Li等[11]采用miR-21基因缺陷小鼠和野生型小鼠建立颚缝扩张动物模型，并体外培养了来自miR-21基因缺陷小鼠和野生型小鼠的骨髓间充质干细胞（BMSC）发现除了第28 d，miR-21基因缺陷小鼠颚缝扩展程度减小，骨缝愈合时间延长，同时碱性磷酸酶及骨钙素含量均减少。进一步研究发现在机械力作用下，缺乏miR-21會破坏骨膜细胞正常增殖，正向调节破骨细胞生成，降低骨保护素的含量，促进核因子-κB（NF-κB）受体活化因子配体的表达，从而提高骨吸收速率，降低骨形成速率。缺少miR-21不但导致骨膜细胞增殖能力下降，而且抑制骨细胞的迁移能力。Sun等[12]在体外细胞实验中发现机械力负载环境下，miR-181c-5p可以直接抑制cyclin B1蛋白的翻译，将成骨细胞分化阻滞在G期，使之无法正常增殖，造成成骨细胞的异常增殖，影响骨生成速率。
机械力负载环境下，Wang等[13]在体外实验中发现miR-33-5p不能影响细胞增殖，但可以直接靶向Hmga2抑制蛋白促进成骨细胞分化。在小鼠动物实验中也证明了机械力环境下miR-33-5p可正向调控成骨细胞分化，减弱部分抑制成骨分化的途径。机械力卸载会导致关节、脊柱等负重部位的受力改变，可引起骨丢失，常发生在卧床制动、太空失重等环境下。Zhang等[14]在体外细胞实验中发现除miR-30a外的miR-30家族在MC3T3-E1细胞卸载条件下表达上调;在机械力卸载环境下，miR-30b、miR-30c、miR-30d和miR-30e靶向Runx2的表达显著增加，并与Runx2的表达呈负相关;进一步研究发现，这4种miRNA能抑制Runx2的表达和成骨细胞的分化，当敲除这些miRNA可以减弱机械力卸载对MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制作用。
模拟微重力条件下，Wang等[15]在MC3T3-E1细胞中发现miR-139-3p和lncRNA-ODSM通过竞争作用调节成骨细胞的分化和凋亡，其中miR-139-3p靶向ELK1抑制分化并促进成骨细胞凋亡。
2.通路调节
miRNA对颅颌面骨改建的调控受多通路影响。研究表明miRNA可以通过骨形态发生蛋白（BMPs）信号通路、Wnt/β-catenin信号通路等进行调节，不同通路调节共同作用体现了miRNA调控骨改建因素的多通路性。
2.1 BMPs信号通路
BMPs大部分属于转化生长因子-β（TGF-β）超家族，miRNA通过BMPs激活BMPs/Smad 等相关BMPs信号通路，调节骨改建，是骨改建调控中的重要途径[16]。BMPs/Smad信号通路是通过BMPs与细胞膜上的丝氨酸/苏氨酸激酶受体BMPs特异性结合激活I型受体（BMPR1），再与细胞内的Smad分子作用，如Smad1、Smad5和Smad8等，转移到细胞核内以调节下游基因的表达[17]。
Li等[18]利用Cre/loxP的杆状病毒载体，在人脂肪来源干细胞（hASC）中过表达BMP-2和miR-148b，发现过表达BMP-2会激活BMPs拮抗剂noggin表达，而miR-148b抑制noggin表达，从而缓解BMP2诱导成骨分化的负向调控，在不影响HASC增殖及Cre/loxP杆状病毒的安全毒性范围内，上调了HASC的成骨。当把共表达BMP-2和miR-148b的hASC植入裸鼠体内，发现在移植后12周对临界大小的颅骨缺损（直径4 mm）产生明显修复，填充骨缺损区域的83%，新生骨是原有缺损的75%的骨体积，并将骨密度恢复到原始骨密度的89%。该研究表明，基于Cre/loxP的杆状病毒介导的BMP-2/miR-148b表达有可能用于颅颌面骨缺损修复修复。
Akkouch等[19]在细胞实验、大鼠的颅骨缺损模型中证实了miR-200c通过直接靶向noggin正向调控BMPs通路，增强成骨分化，同时抑制Wnt通路拮抗剂Klf4和Sox2的表达，间接提高Wnt信号转导活性。在miR-200c作用下，BMPs通路与Wnt通路协同作用，促进成骨细胞的分化和颌面骨的再生。
2.2 Wnt/β-catenin通路
骨修复是一个复杂的动态过程，Wnt/β- catenin信号通路是骨修复邻域最关键的信号通路之一，对胚胎发育过程中的形态发生和细胞组织具有重要的作用。该系统通常在成年时被抑制，但在器官损伤和再生过程中可以被重新激活，受到严格调控。
骨修复的过程需要血管神经营养支持，当骨改建区域神经支配不足时，会影响改建的速度。阿司匹林常被用作NSAID，治疗中度疼痛、炎症和心血管疾病。Lei等[20]在大鼠下颌骨缺损模型中发现，miR-222联合阿司匹林的混合物，可以在阿司匹林纠正骨缺损区域炎症环境下，通过miR-222激活Wnt/β-catenin/Nemo-like激酶信号通路诱导人BMSC分化为神经样细胞，在大鼠下颌骨缺损区注射搭载二者的水凝胶可促进骨改建区域新骨形成。
Liu等[21]在检测去卵巢组、假手术组、miR-141激动剂组和miR-141拮抗组大鼠颌骨骨密度和病理改变中发现miR-141过表达可通过激活Wnt/β-catenin途径抑制去卵巢大鼠颌骨骨质疏松。Sui等[22]在体外细胞学实验证明miR-335-5p通过下调Wnt拮抗剂Dickkopf-1来促进成骨分化，并利用纳米材料将miR-335-5p导入成骨细胞，通过脂类传递miRNA可以诱导干细胞成骨分化和骨再生，促进体外成骨和小鼠体内颅骨愈合，结果显示颅骨缺损修复明显。
3.炎性因子
miRNA在炎性因子作用下进行骨改建的调控根据结合情况可分两种，包括直接与炎症因子结合调控骨改建，和在炎症微环境作用下激活其他细胞因子进行间接调控。颅颌面骨炎症微环境在牙周病患者中普遍存在。牙周病是全球公认的常见疾病，可导致牙周纤维束的降解和牙槽骨骨质流失，造成牙松动脱落，使患者生活质量降低。形成新骨被认为是治疗牙周病最有效的方法之一，但现有的研究仍未完全阐明炎性微环境的骨改建机制，因此对牙周病的治疗也相对有限[23]。多项研究表明，miRNA在炎症环境中对新骨形成具有调节作用[23-24]。Gon?alves Fernandes等[25]研究发现，与牙周健康的受试者相比，患有局部侵袭性牙周炎（LAP）的患者在TLR4和TLR2结合后产生的促炎细胞有6种以上miRNA存在显著差异，LAP中miR-9-5p、miR-155-5p、203a-3p、miR-147a、miR-182-5p和miR-183-5p等miRNA表达显著上调。多数基因与miRNA的过度表达和炎症反应有直接或间接的关系。
3.1 TNF-α
TNF-α可以促进炎症以及肿瘤的发展，在细胞各种病理生理状态中进行免疫调节。Zou等[26]通过体外细胞实验以及构建小鼠模型发现，低浓度（0.01 ～ 0.1 ng/ml）? 的TNF-α可促进miR-21的表达，高浓度（1 ～ 10 ng/ml）的TNF-α可抑制miR-21的表达和成骨活性。不同TNF-α浓度下，miR-21通过激活JAK2/STAT3通路，调控炎症下的骨改建，表明miR-21在炎症状态下具有调控能力，并且这种调控能力与炎症因子的浓度相关。Ohnuma等[27]在体外细胞实验证明miR-124抑制TNF-α和IL-6诱导的破骨细胞分化。
3.2 IL-6
IL-6是一种多功能细胞因子。IL-6在启动免疫应答中具有重要作用，与慢性炎症微环境有关，具有免疫调节功能，并在机体病理生理中都起重要作用。Wang等[28]在体外细胞实验及小鼠实验中发现，miR-181b-5p通过靶向成牙骨质细胞中的IL-6来调节TNF-α诱导的炎症反应。在TNF-α刺激的OCCM30成骨细胞中，过表达miR-181b-5p可负性调节IL-6并导致相应成骨细胞凋亡，使处于炎症微环境中的成骨细胞无法进行病理反应，减少TNF-α产生，在小鼠模拟成牙骨质细胞的炎症环境下，过表达miR-181b-5p可负性调节IL-6。蛋白免疫印迹法分析和荧光素酶活性报告基因检测表明，miR-181b-5p降低NF-κB的活性。因此，miR-181b-5p通过靶向IL-6，在成牙本质细胞中调节促炎趋化因子的产生，并参与NF-κB信号转导。此外，miR-181b-5p可促进成牙本质细胞凋亡，促进炎症消退。
Lian等[29]在高表达miR-335-5p（335-TG）转基因小鼠上建立实验性牙周炎（EP）模型，通过实施定量PCR檢测炎症和破骨细胞基因表达，及显微计算机断层扫描（μCT）对牙槽骨形态进行分析发现，与WT-EP组相比，μCT分析显示335-TG-EP组骨质丢失较少，IL-6的表达明显降低，同时TRAP阳性破骨细胞数量减少，HE染色法和免疫组织化学染色法显示335-TG-EP组炎症减轻。
三、总结与展望
miRNA在颅颌面骨组织改建过程中的调控具有多样性。近年来的研究表明，miRNA在机械力刺激下通过调节细胞的增殖、分化和凋亡来调控骨改建。通过譬如BMP或Wnt等不同信号通路进行协作调控，加强了miRNA在调控骨改建中各因子间联系。炎症微环境下，miRNA与炎性因子作用，进而调控骨改建。因此，对miRNA在骨改建调控中的研究需要结合多因素共同考虑。同时，对miRNA的研究也从微观角度补充了骨改建调控的分子机制，为临床颅颌面骨改建及缺损修复提供参考依据。
参 考 文 献
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（收稿日期：2020-12-10）
（本文編辑：郑巧兰）
