新型锆离子固定化亲和磁纳米粒子的制备及在磷酸化肽高效捕获中的应用

    赵艳艳 张丽华 张丽媛

    

    

    

    摘?要?蛋白质磷酸化是最常见、最重要的翻译后修饰之一， 在细胞信号传导、细胞凋亡等生物学过程中起关键的调控作用。但是， 磷酸化蛋白/肽具有低丰度和负电荷的特点， 在生物质谱常规的正离子模式下， 易受到高丰度非磷酸化蛋白/肽的信号抑制， 难以直接对其进行直接分析。因此， 有必要在质谱分析前对生物样品中的磷酸化蛋白/肽进行选择性富集。本研究基于三磷酸腺苷（ATP）配基， 制备了新型锆离子固定化亲和磁纳米粒子（Zr4+-ATP-MNP）。扫描电镜和元素分析的表征结果表明， Zr4+-ATP-MNP制备成功。采用所制备的Zr4+-ATP-MNP材料对磷酸化肽进行富集， 以磷酸化蛋白β-酪蛋白（β-casein）的酶解液为选择性实验模式样品， 采用质谱法可鉴定出9条磷酸化肽; 以β-casein和非磷酸化蛋白牛血清白蛋白（BSA）酶解液（1∶100， n/n）混合物为干扰实验模式样品， 采用质谱可鉴定出5条磷酸化肽。富集后， 磷酸化肽的质谱信号强度显著提高， 可有效去除非磷酸化肽。Zr4+-ATP-MNP在牛奶酶解产物中的应用进一步表明， 其对复杂生物样品中的单磷酸化肽和多磷酸化肽具有广谱性的捕获潜力。

    关键词?固定化亲和; 磷酸化肽; 富集; 磁性

    1?引 言

    蛋白质的磷酸化是一种普遍存在的蛋白质翻译后修饰，在细胞信号传导、细胞代谢、细胞周期和激酶调控等重要生命活动中起关键作用[1，2]。基于质谱的磷酸化蛋白质组学技术为生物学研究提供了极佳的分析平台[3]。然而，磷酸化蛋白的低丰度、动态可逆、难以离子化等特点，使得难以对其直接进行质谱检测。因此，发展可应用于质谱前生物样品预处理的高选择性富集材料，并将其应用于磷酸化蛋白质组学研究，具有重要意义。

    金属离子固定化亲和色谱（Immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC）是一种应用广泛的磷酸化肽选择性富集技术[4～8]，主要利用固定后的金属离子与磷酸化肽的磷酸根之间的螯合作用，实现材料对磷酸化肽的选择性捕获。常用的金属离子有Fe3+ [9～12]、Ga3+ [7，13～15]和Ti4+ [8，16]等，常用于固定化金属离子的基团有亚氨基二乙酸（IDA）[9，17]和次氨基三乙酸（NTA）[8，10，12]等。为了提高富集选择性，Zou和Zhang的研究组等发展了以磷酸根为配基的多种功能IMAC新材料[4，18～20]。最近，本研究组发展了以三磷酸腺苷（ATP）为配基的新型IMAC材料[15，16]。ATP含有3个磷酸根基团，可同时提供多个金属离子螯合位点，以其为螯合基团的IMAC 材料可与金属离子形成稳定的网状化合物，为磷酸化肽提供高活性的富集位点。此外，ATP结构中含有亲水性基团，如戊糖（核糖）和嘌呤碱（腺嘌呤），可显著提高材料的亲水性，降低对非磷酸肽的非特异性吸附，提高材料的磷酸化肽富集选择性。前期研究结果表明，以ATP为配基固载单一种类金属离子所制备的材料，难以实现单磷酸化肽和多磷酸化肽的同时高选择性富集，如固载Ga3+后的Ga3+-ATP-MNP偏向于富集多磷酸化肽[15]，而固载Ti4+后的Ti4+-ATP-MNP更偏向于富集单磷酸化肽[16]。因此，有必要发展一种可同时富集单磷酸化肽和多磷酸化肽的富集方法。

    在前期研究的基础上，本研究以磁性纳米粒子为基质，以ATP为功能化试剂，通过固定化Zr4+，制备了对单磷酸化肽和多磷酸化肽具有广谱性富集效果的新型锆离子固定化亲和磁纳米粒子（Zr4+-ATP-MNP）。此纳米粒子对磷酸化肽的富集选择性好，在牛奶酶解产物中的应用表明，其具有捕获复杂生物样品中磷酸化肽的应用潜力。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    JSM-6360 LV型扫描电镜（JEOL， 日本Tokyo公司）;Ultraflex III MALDI-TOF/TOF 质谱仪（德国Bruker 公司）。三磷酸腺苷二钠（ATP-Na2，纯度≥99.9%，美国AMRESO公司）;氯氧化锆（ZrOCl2，中国医药集团上海化学试剂公司）;β-酪蛋白质（β-Casein）、牛胰蛋白质酶（Trypsin）、牛血清蛋白质（BSA）、尿素、2，5-二羟基苯甲酸（DHB）、二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA）、戊二醛（50%，w/w）、甲酸（FA）、三氟乙酸（TFA）、ZrO2 颗粒（5 μm）均购自美国Sigma Aldrich公司;乙腈（色谱纯，德国Merck公司）;其余试剂均为分析纯。实验用水为经Milli-Q 超纯水处理系统（美国Millipore公司）纯化的超纯水。

    2.2?实验方法

    2.2.1?Zr4+-ATP-MNP的制备?在前期研究工作[15，16]基础上，制备了Zr4+-ATP-MNP。 以FeCl3·6H2O（1 g）、1，6-己二胺（3.6 g）与无水乙酸钠（4 g）为原料、50 mL 乙二醇为溶剂，利用水热合成法，在反应釜中于200℃反应6 h，得磁性纳米颗粒基质。将磁性纳米颗粒分别经乙醇与水超声清洗3次， 称取100 mg，加入5 mL 戊二醛溶液（20% （w/w）， 100 mmol/L 柠檬酸缓冲液，pH 5.0），室溫下活化2 h。用柠檬酸缓冲液（100 mmol/L， pH 5.0），清洗5次，去除未反应的戊二醛。加入3 mL ATP 溶液（0.2 g/mL， 100 mmol/L 柠檬酸缓冲液，pH 5.0），室温下反应2 h，使磁球纳米粒子表面ATP 功能化。用柠檬酸缓冲液（100 mmol/L， pH 5.0）清洗5次，去除未反应的ATP。最后加入10 mL ZrOCl2溶液（100 mmol/L， 0.1% （V/V） FA），固载Zr4+ 2 h，所得磁性纳米粒子用0.1% （V/V） FA 清洗5次后，于0.1% （V/V） FA 中保存，备用。

    2.2.2?样品处理?将1.0 mg β-casein溶于1 mL NH4HCO3（50 mmol/L， pH 8.0）中，以1∶50（w/w）的酶-蛋白比例加入Trypsin，37℃酶解12 h。将1.0 mg BSA 溶于100 μL 含8 mol/L 尿素的50 mmol/L NH4HCO3中，56℃变性10 min，加入20 μL 100 mmol/L DTT， 56℃反应1 h。冷却至室温后，加入20 μL 200 mmol/L IAA，在暗处反应30 min，用50 mmol/L NH4HCO3稀释至1 mL后，以1：50（w/w）的酶-蛋白比例加入Trypsin， 37℃酶解12 h。脱脂牛奶经Bradford法测定蛋白质浓度后，酶解流程同BSA。酶解产物经甲酸中止反应，于

    80℃保存。

    2.2.3?Zr4+-ATP-MNP应用于磷酸化肽的捕获?Zr4+-ATP-MNP的上样、淋洗及洗脱条件参见文献[15，16]。即取5 μL Zr4+-ATP-MNP （10 μg/μL）与10 μL样品溶液，在上样溶液（50% ACN/5% TFA）中振荡孵育30 min 后，分别用200 μL淋洗缓冲溶液1（50% ACN/5% TFA/200 mmol/L NaCl）、淋洗缓冲溶液2（80% ACN/5% TFA）和淋洗缓冲溶液3（30% ACN/0.1% TFA）順序淋洗，去除非磷酸化肽，最后加入50 μL NH4OH（15%，w/w）进行洗脱，洗脱液冻干后，加入2 μL 的基质溶液（25 mg/mL DHB，50% ACN/1% H3PO4）重溶后，进行MALDI-TOF MS 分析。

    3?结果与讨论

    3.1?Zr4+-ATP-MNP材料表征

    利用扫描电镜对制备的Zr4+-ATP-MNP进行了表征。由图1A可见，制备的Zr4+-ATP-MNP形貌均一，为直径150 nm左右的球形粒子。由元素分析结果（图1B）可知，Zr4+-ATP-MNP主要含Zr、Fe、O等元素，进一步证明Zr4+-ATP-MNP制备成功。

    3.2?Zr4+-ATP-MNP对磷酸化肽的富集选择性考察

    以β-casein（纯度90%，混有部分α-casein）为样品，考察了Zr4+-ATP-MNP对磷酸化肽的选择性，结果如图2所示。由图2A可见，不经富集直接进行质谱检测，仅检出3条代表性磷酸化肽（m/z 2061、2555和3122），且信号几乎被其它高丰度非磷酸化肽掩盖。经Zr4+-ATP-MNP富集后，上述3条磷酸化肽的质谱信号强度显著提高;此外，还检测到1条源于β-casein（m/z 2431）和5条源于α-casein（m/z 1466、1660、1927、1951和2083）的磷酸化肽（图2B）。商品化ZrO2颗粒仅可富集到6条磷酸化肽（图2C）。以上结果表明，与商品化ZrO2颗粒的富集效果相比，Zr4+-ATP-MNP对低丰度磷酸化肽具有更强的亲和作用力。此外，富集到的磷酸化肽中既含有单磷酸化肽（m/z 1461、1660、1951、2061、2083、2431和2555），又含有多磷酸化肽（m/z 1927和 3122）。以上结果表明，Zr4+-ATP-MNP对磷酸化程度不同的肽段具有广谱性富集效果。本研究所检测到的磷酸化肽氨基酸序列见表1。

    以β-casein和 BSA 的混合物（1∶100， n/n）为干扰实验模式样品，进一步考察了Zr4+-ATP-MNP对复杂样品中磷酸化肽的富集能力。由图3A可见，未经过富集直接检测，仅能检测到高丰度的非磷酸化肽，未检测到磷酸化肽。但是，经Zr4+-ATP-MNP富集后（图3B），即使在高丰度的非磷酸化肽干扰下，源于β-casein的3条单磷酸化肽（m/z 2061、2431和2555）和源于α-casein的1条单磷酸化肽（m/z 2083）仍以高信噪比被检出。此外，源于β-casein的1条多磷酸化肽（m/z 3122）还被高效鉴定。以上结果表明，即使在高丰度的非磷酸化肽干扰下， Zr4+-ATP-MNP对痕量的单磷酸化肽和多磷酸化肽均具有较好的捕获能力。Zr4+-ATP-MNP中的抗干扰特性可归结于ATP配基的亲水性。ATP配基中含有亲水性戊糖（核糖）和嘌呤碱（腺嘌呤），修饰ATP配基可显著提高Zr4+固定化亲和磁纳米粒子材料的亲水性，从而降低对非磷酸化肽的非特异性吸附。此外，ATP配基含有3个磷酸根基团，可以同时提供多个Zr4+螯合位点，其与Zr4+形成稳定的网状化合物，为磷酸化肽富集提供高活性的富集位点。

    3.3?Zr4+-ATP-MNP用于牛奶蛋白酶解产物中磷酸化肽的选择性富集

    进一步以牛奶蛋白酶解产物为样品，考察了Zr4+-ATP-MNP对实际生物样品中磷酸化肽的富集能力。如图4所示，直接进行质谱分析时，由于非磷酸化肽的干扰和抑制效应，磷酸化肽的信号较低，仅可检测到2条磷酸化肽;经Zr4+-ATP-MNP富集后，共检测到11条磷酸化肽，磷酸化肽的鉴定数量和质谱响应信号均显著提高。进一步将此富集结果与前期发展的Ga3+-ATP-MNP[15]和 Ti4+-ATP-MNP[16]进行比较，结果如图5所示。从富集后磷酸化肽质谱信号强度的信噪对比结果可知，Zr4+-ATP-MNP对单磷酸化肽的富集能力与Ga3+-ATP-MNP和 Ti4+-ATP-MNP相当（图5A）;其对多磷酸化肽的富集能力强于Ti4+-ATP-MNP，与Ga3+-ATP-MNP相当（图5B）。并且，Zr4+-ATP-MNP对单磷酸化肽和多磷酸化肽的富集选择性与Ti4+-ATP-MNP、Ga3+-ATP-MNP具有一定互补性。以上结果进一步表明，Zr4+-ATP-MNP对实际生物样品中单磷酸化肽和多磷酸化肽具有广谱性捕获潜力。

    1（College of Basic Medical Sciences， Dalian Medical University， Dalian 116044， China）

    2（CAS Key Laboratory of Separation Sciences for Analytical Chemistry， Dalian Institute of Chemical Physics，

    Chinese Academy of Sciences， Dalian 116023， China）

    3（College of Pharmacy， Dalian Medical University， Dalian 116044， China）

    Abstract?Protein phosphorylation is one of the most common and important post-translational modifications， which plays key regulatory roles in biological processes， such as cell signaling and apoptosis. However， due to the low abundance and negative charge of phosphorylated proteins， in the conventional positive ion mode of bio-mass spectrometry， phosphoproteins are susceptible to be suppressed by high-abundance non-phosphorylated proteins， making them difficult to be directly analyzed. Therefore， the enrichment of phosphorylated proteins/peptides prior to mass spectrometry is important in biological research. For the first time， in this study， a novel zirconium ion-immobilized affinity magnetic nanoparticle （Zr4+-ATP-MNP） was prepared using adenosine triphosphate （ATP） as the ligand. The ATP ligand in Zr4+-ATP-MNP contains three phosphate groups， which can simultaneously provide multiple zirconium ion chelating sites， thus form stable network compounds with zirconium ions and provide high activity towards phosphorylated peptide. In addition， the hydrophilic pentose （ribose） and purine （adenine） parts in the ATP structure can significantly increase the hydrophilicity of the material and reduce the non-specific adsorption from non-phosphorylated peptides. The results of scanning electron microscopy and elemental analysis indicated that Zr4+-ATP-MNP was successfully prepared. Using β-casein digest as the sample， 9 phosphopeptides were identified. From digest mixture of β-casein and BSA with molar ratio as low as 1∶100， five phosphopeptides were effectively identified with significantly improved signal and the non-phosphorylated peptides were effectively removed. The above results demonstrated the high specificity of Zr4+-ATP-MNP for both monophosphorylated peptides and multiphosphorylated peptides. The Zr4+-ATP-MNP was further applied to capture phosphopeptides in milk digest. All these results indicated the promising potential of Zr4+-ATP-MNP to capture mono-?and multi-phosphopeptides in complex biological samples.

    Keywords?Immobilized affinity; Phosphopeptide; Enrichment ; Magnetic

    （Received 18 November 2019; accepted 19 December 2019）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21974017， 21505015）， the Project of CAS Key Laboratory of Separation Sciences for Analytical Chemistry， Dalian Institute of Chemical Physics， Chinese Academy of Sciences， the Program in Liaoning Province Education Department （No. LZ2019063）， the Natural Science Foundation of Liaoning Province， China （No. 20170540286）， and the Dalian High-level Talents Innovation Support Program （No. 20170540286）.