波谱形变定量理论结合核壳型颗粒用于生物样本中6-硫鸟嘌呤的检测

    王颖琦 陈瑶 陈增萍

    

    

    

    摘?要?制备了[email protected]巯基苯甲酸@Ag-shell核壳型纳米颗粒， 结合波谱形变定量分析理论， 采用表面增强拉曼光谱（SERS）定量分析了尿液和红细胞样本中6-硫鸟嘌呤（6-TG）。实验结果表明， 核壳型纳米颗粒和波谱形变定量分析理论相结合可以有效消除SERS增强基底表面的“热点”数目及其分布等因素的变化对SERS信号的乘子效应影响， 从而实现尿液和红细胞样本中6-TG的灵敏、准确定量分析。本方法对6-TG的检出限（3σ）和定量限（10σ）分别为1 nmol/L 和3 nmol/L ， 加标回收率在95.6%～106.7%之间。相较于传统的6-TG分析方法（如高效液相色谱法）， 本方法具有简单、灵敏、快速等优点， 为复杂体系中6-TG的常规定量分析提供了参考。

    关键词?表面增强拉曼光谱; 6-硫鸟嘌呤; 核壳型纳米颗粒; 波谱形变定量分析理论

    1?引 言

    6-硫鸟嘌呤（6-TG）为抗肿瘤药物， 可用于各类白血病， 尤其是急性白血病的治疗[1]。6-TG具有一定的毒副作用， 其中骨髓抑制是最常见的不良反应[2]。所以， 在用药期间必须严格检查病人血象， 监测6-TG浓度。目前， 已报道的测定6-TG的方法包括高效液相色谱法[2]、液相色谱-质谱法[3]、电化学分析法[4]和荧光分析法[5]等。这些方法存在样品预处理繁琐费时或选择性不佳等缺点。如使用高效液相色谱法对6-TG进行定量分析时， 由于6-TG在紫外-可见光区的吸收不强， 导致检出限较高， 所需样本的体积较大。因此， 发展简便、快速、灵敏度高、所需样本量小的6-TG的定量分析方法具有重要意义。

    表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman spectroscopy， SERS）是待测物分子接近或吸附在粗糙金属纳米材料表面时， 导致拉曼散射增强的一种灵敏的分析技术[6]， 具有灵敏度高、制样简单、检测速度快等优点。SERS属于表面分析技术， 信号强度不仅取决于待测物质的浓度， 而且与SERS增强基底表面的“热点”数目及其分布等因素的变化有关， 从而导致SERS信号重现性较差， 其定量分析结果的准确度难以达到实际定量分析的要求。在实际的SERS定量分析中， 通常采用内标法提高SERS定量分析结果的准确度[7]。然而， 传统内标法要求内标必须具有与待测物质不重叠的SERS光谱峰， 这使得内标物质的选取比较困难。近年来， 本研究组发展和完善了一个全新的波谱定量分析理论， 即波谱形变定量分析理论[8]， 并将其与内标法相结合， 成功用于提高SERS定量分析结果的准确度[9～13]。基于波谱形变定量分析理论的内标法仅要求内标的SERS光谱不与待测物质的SERS光谱完全重叠即可， 方便了内标的选取。本研究尝试将内标嵌入式核壳型纳米颗粒与波谱形变定量分析理论相结合， 用于尿液和红细胞中6-TG含量的快速准确定量分析。

    2?实验部分

    2.1?仪器与试剂

    BWS456-785H便携式拉曼光谱仪（i-Raman， 必达泰克光电科技上海有限公司）; LC-20AT高效液相色谱仪（HPLC， 日本岛津公司）， C18ODS柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）; Tecnai G2 20透射电子显微镜（FEI香港有限公司）。

    浓HCl和浓HNO3（株洲化工研究所）;AgNO3、KCl、二水合檸檬酸三钠（C6H5Na3O7 ·2H2O）和Zonyl FSN-100杜邦非离子全氟表面活性剂（上海西格玛奥德里奇贸易有限公司）;4-巯基苯甲酸（4-MA）、 6-TG、 抗坏血酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）; 四水合氯金酸（HAuCl4·4H2O， 上海国药集团化学试剂有限公司）; 健康人尿液样本由志愿者提供; 红细胞由湖南讴睿生物科技有限公司提供， 并获得了湖南大学生物学院实验动物伦理委员会的批准。实验用水均为超纯水（18.25 MΩ·cm， 重庆艾科浦公司纯水系统）。所用溶剂和化学试剂均至少为分析纯， 未经纯化直接使用。

    2.2?嵌入内标分子的核壳型纳米颗粒[email protected]@Ag-shell的制备

    实验中所用玻璃器皿均在王水（HCl+HNO3， 3∶1， V/V）中浸泡8 h以上， 用水冲洗， 烘干后使用。采用传统的柠檬酸三钠还原氯金酸的方法[14]合成40 nm金纳米颗粒。然后参考文献报道的方法[13， 15]并稍作改进制备[email protected]@Ag-shell。其步骤如下： 将2 mL 40 nm金纳米颗粒以9000 r/min离心15 min， 浓缩至1 mL后转移至圆底烧瓶中， 依次加入50 μL 0.5%（w/V）FSN稳定剂和5 μL 10 μmol/L 4-MA溶液。反应6 h后， 将上述溶液以9000 r/min离心15 min两次， 去除多余的4-MA， 然后将获得的沉淀用超纯水重新分散于圆底烧瓶中。再依次加入50 μL 0.5% FSN、1 mL 1 mmol/L抗坏血酸和800 μL 1 mmol/L AgNO3溶液。反应15 min后，9000 r/min离心15 min， 弃去上清液， 沉淀重新分散于1 mL超纯水中， 于4℃避光保存， 待用。

    2.3?样品制备

    称取0.0017 g 6-TG溶于1 mL 100 mmol/L NaOH中， 得到10 mmol/L 6-TG母液， 于4℃保存， 备用。将10 mmol/L 6-TG母液用水逐级稀释， 得到1 μmol/L 6-TG储备液。移取不同体积的6-TG储备液， 用水稀释至500 μL， 得到一系列浓度的6-TG标准溶液样本（0、0.0050、0.0100、0.0200、0.0400、0.0600、0.0800、0.1000、0.1300、0.1500、0.1800、0.2000、0.2300 μmol/L）， 其中6-TG浓度水平为0、0.0050、0.0200、0.0600、0.1000、0.1300、0.1500、0.2000和0.2300 μmol/L的标准溶液组成校正样本集， 6-TG浓度水平为0.0100、0.0400、0.0800和0.1800 μmol/L的标准溶液组成验证样本集。

    移取1 mL健康人尿样（HPLC未检测出6-TG）于10 mL离心管中， 加水稀释10倍。将50 μL尿样上清液与不同体积的6-TG储备液混合， 并用水稀释至0.5 mL， 得到含有不同浓度6-TG的尿液加标样本（加标浓度分别为0、0.0400、0.0900和0.1300 μmol/L）。

    取健康C57BL/6小鼠的全血6 mL， 以1200 r/min离心10 min， 弃去上清液， 沉淀用2倍体积的0.9% （W/V） NaCl溶液洗涤两次，1200 r/min 离心10 min， 用4 mL 0.9% （W/V） NaCl溶液重悬红细胞。取1 mL红细胞重悬液加入4 mL冰水中， 涡旋振荡，12000 r/min离心10 min， 上清液即为红细胞裂解液， 于-20℃保存， 待用。移取1 mL红细胞裂解液（用HPLC未检测出6-TG）于10 mL离心管中， 加水稀释10倍。将50 μL如上稀释的红细胞裂解液与不同体积的6-TG储备液混合， 并用水稀释至0.5 mL， 得到含有不同浓度的6-TG红细胞裂解液加标样本（加标浓度分别为0、0.0500、0.0800和0.1500 μmol/L）。

    2.4?样本SERS光谱的采集

    将10 μL样本（标准溶液样本、尿液加标样本和红细胞裂解液加标样本）、10 μL核壳型纳米颗粒溶液和2.5 μL 2 mol/L KCl溶液充分混合后， 吸取20 μL混合液滴入玻璃锥孔内， 使用耦合了BAC151A拉曼影像显微镜采样系统的便携式拉曼光谱仪采集其SERS光谱， 拉曼位移范围：300～1800 cm

    1; 激光波长： 785 nm; 激光功率： 100 mW; 物镜倍数： 20倍; 曝光时间： 3000 ms。每个样本重复测量3次。

    2.5?HPLC实验

    分别移取1 mL尿液和红细胞裂解液于10 mL离心管中， 用甲醇稀释10倍， 超声10 min， 放置30 min， 以7000 r/min离心20 min， 用一次性注射器吸取上清液， 用0.22 μm滤膜过滤， 得到尿液和红细胞裂解液样本。采用岛津LC-20AT高效液相色谱仪（C18 ODS柱色谱柱; 柱温： 32℃; 流动相： 0.1%甲酸-甲醇（80∶20， V/V）; 流速： 1 mL/min; 检测波长： 340 nm）对尿液和红细胞裂解液样本中6-TG的含量进行检测， 6-TG保留时间为5 min。每个样本重复检测3次。

    3?结果与讨论

    3.1?实验原理

    本研究采用核壳型纳米颗粒[email protected]@Ag-shell作为SERS增强基底对6-TG进行定量检测， 原理见图1。由于内标物质4-MA标记在Au核上， Au核外表面沉积了一层Ag壳， 因此在对6-TG进行SERS检测过程中， 4-MA不会从SERS增强基底上脱附下来， 也不与6-TG竞争SERS增强基底表面上（即Ag壳表面）的吸附位点， 因此内标物质4-MA的量是固定的， 在一定程度上提高了SERS技术对6-TG的检测灵敏度。如图2所示，1073 cm

    1（CH面內弯曲振动）和1580 cm

    1（CC拉伸振动）处为[email protected]@Ag-shell核壳型颗粒中内标物质4-MA的SERS特征峰[16]; 6-TG在[email protected]@Ag-shell核壳型颗粒上的SERS特征峰在916 cm

    1（N1C6弯曲振动）[17]、954 cm

    1（N7C8变形振动）[18]、1247 cm

    1（C8N9变形振动）和1297 cm

    1（嘌呤环的CN的伸缩振动）处[19]。内标物质与待测物质的SERS光谱有显著的差异， 因此可以采用内标法对6-TG进行定量检测。

    3.2?[email protected]@Ag-shell增强基底的表征及其稳定性

    本研究组前期研究结果表明[13]， 以40 nm金核制备的[email protected]@Ag-shell的SERS增强效果较好。由图3可见， 此核壳型纳米颗粒以40 nm金颗粒作为核， 厚度约4 nm的银作为壳， 银壳较好地包覆在金核的周围。在进行SERS检测时， 加入KCl作为聚集剂， 所获得6-TG在916 cm1处的SERS峰强度与内标4-MA在1073 cm1处的SERS峰强度的比值（I916/I1073）较大。因此， 在后续定量检测实验中， 采用40 nm金核为基础制备的[email protected]@Ag-shell作为SERS增强基底， 并采用KCl作为聚集剂。

    将合成好的核壳型纳米颗粒于4℃储存， 放置不同时间后， 测试同一批次颗粒的SERS信号。如图4所示， 由于存在稳定剂Zonyl FSN-100， 且低温避光保存， 储存30天后， 其SERS增强效果变化不大， 表明此核壳型纳米颗粒具有较好的稳定性， 是优良的SERS增强基底。

    3.3?校正模型

    如图5所示， 随着标准溶液样本中6-TG浓度的逐渐增加， 6-TG在916 cm1处的SERS峰强度与内标4-MA在1073 cm1处的SERS峰强度的比值（I916/I1073）首先呈现上升的趋势， 当6-TG的浓度超过0.1 μmol/L后， I916/I1073逐渐减小， 而且同一个样本的3次重复测量的信号之间的差异也十分明显。导致这一现象的主要原因在于进行SERS检测时无法控制增强基底[email protected]@Ag-shell表面的“热点”数目及其分布， “热点”数目及其分布的变化对样本SERS光谱信号的影响难以通过简单地计算两个SERS峰强度的比值而有效地消除。

    为了消除进行SERS增强基底表面的“热点”数目及其分布的变化对6-TG样本SERS光谱信号的影响， 本研究采用前期提出的如下波谱形变定量分析理论（Spectral shape deformation， SSD）[8]对6-TG样本的表面增强拉曼光谱进行定量分析。

    xk=bk·（c6-TG，k·r6-TG+c4-mA，k·r4-MA）+dk; （k=1，2，…，K）（1）

    其中， xk为第k个校正样本的SERS光谱; c6-TG，k为第k个校正样本中6-TG的浓度; c4-MA，k为核壳型纳米颗粒中标记的内标4-MA的浓度; r6-TG和r4-MA分别代表6-TG和4-MA单位浓度的SERS响应;

    模型参数bk表示SERS增强基底表面的“热点”数目及其分布等因素的变化对第k个校正样本的SERS光谱信号强度产生的乘子效应; dk表示背景干扰等对第k个校正样本SERS光谱信号产生的非乘子效应。由于内标物4-MA的浓度c4-MA为常量， 以上SSD模型中校正样本的参数bk （k=1，2，…，K）可以用改进光程估计与纠正的方法（Modified optical path length estimation and correction， OPLECm）[20]进行估算。获得模型参数bk（k=1，2，…， K）后， 采用多元线性回归方法（Partial least squares， PLS）[21]在xk与bk之间， 以及xk与bkc6-TG， k之间建立

    两个校正模型。获得待测样本的SERS光谱xtest后， 样本中6-TG的浓度可以由第二个校正模型的预测值除以第一个校正模型的预测值获得。

    SSD校正模型建立在校正集样本的SERS光谱数据基础上， 校正模型的最优参数值是根据校正模型对验证集样本的预测均方根误差最小这一标准确定的。图6为SSD校正模型对校正集和验证集中6-TG浓度的预测结果。SSD模型对校正集和验证集的定量分析结果的均方根误差分别为0.008和0.010 μmol/L， 对验证集的定量分析结果的平均相对预测误差为11.3%。上述结果表明， SSD校正模型能有效地消除SERS增强基底表面的“热点”数目及其分布等因素的变化对SERS定量分析结果的不利影响。值得指出的是， 當6-TG的浓度为0.23 μmol/L时， SSD模型的预测结果比实际浓度稍有偏低， 这主要是因为此时吸附在增强基底[email protected]@Ag-shell表面上的6-TG接近饱和。进一步增加样本中6-TG的浓度不会引起样本SERS信号的显著变化， 因此， 可认为在本实验检测条件下， SSD校正模型对6-TG的检测上限约为0.23 μmol/L。

    3.4?生物样本中6-TG的定量分析结果

    表1为采用SSD校正模型对尿液加标样本和红细胞裂解液加标样本中的6-TG的定量分析结果。对于未添加6-TG的尿液和红细胞裂解液样本（采用HPLC方法未检出6-TG）， SSD校正模型未检出6-TG; 对于添加了6-TG的尿液和红细胞裂解液样本， SSD校正模型定量分析结果的回收率在95.6%～106.7%之间。结果表明， [email protected]@Ag-shell纳米颗粒与SSD校正模型相结合能够实现复杂生物样本（如尿液、红细胞裂解液等）中6-TG的准确定量分析， 检测限（3σ）和定量限（10σ）分别约为1 nmol/L和3 nmol/L， 定量检测浓度范围为0.003～0.23 μmol/L; 待测样本基质的变化和SERS增强基底表面的“热点”数目及其分布的变化对定量分析结果没有显著影响。

    有文献报道高效液相色谱法对6-TG的检出限约为0.02 mg/L（约0.1 μmol/L）[22]。相比于高效液相色谱法， 本方法对6-TG的检出限更低。虽然文献中的其它方法（如液相色谱-质谱法[3]、电化学分析法[4]和荧光分析法[5]等）对6-TG也具有较高的检测灵敏度， 但这些方法均需要对样本进行较为繁琐、耗时的前处理或复杂的分离过程。本方法具有样品前处理简单、检测时间短等优点， 有望发展成为一种简单、快速、灵敏的检测6-硫鸟嘌呤的新方法。

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    Quantification of 6-Thioguanine in Biological Samples

    by Spectral Shape Deformation Quantitative Theory

    Combined with Core-shell Nanoparticles

    WANG Ying-Qi1， CHEN Yao*2， CHEN Zeng-Ping*1

    1（State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics，College of Chemistry and Chemical Engineering，

    Hunan University，Changsha 410082，China）

    2（Hunan Key Lab of Biomedical Materials and Devices，College of Life Sciences and Chemistry，

    Hunan University of Technology，Zhuzhou 412008，China）

    Abstract?The core-shell nanoparticles （i.e.，[email protected] [email protected]） were combined with spectral shape deformation （SSD） quantitative model for quantification of 6-thioguanine （6-TG） in urine and red blood cell lysate samples. Experimental results showed that the combination of core-shell nanoparticles with SSD model could effectively remove the detrimental multiplicative effects on samples' surface enhanced Raman spectroscopy （SERS） signals caused by the variations of the number of “hot spots” and their distribution near/on the surfaces of SERS enhancing substrates，and hence realized the accurate quantitative determination of 6-TG in urine and red blood cell lysate samples with recovery of 95.6%-106.7%. The limit of detection （3σ） and limit of quantification （10σ） for 6-TG were estimated to be about 1 and 3 nmol/L，respectively. Compared with conventional methods for analysis of 6-TG such as high performance liquid chromatography （HPLC），the proposed method had many advantages such as simplicity，rapidity and high sensitivity，and had great potential in routine quantitative analysis of 6-TG in complex samples.

    Keywords?Surface enhanced Raman spectroscopy;6-Thioguanine;Core-shell nanoparticles;Spectral shape deformation quantitative theory

    （Received 13 July 2019;accepted 3 December 2019）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21705044，21775038） and the Natural Science Foundation of Hunan Province，China （No. 2018JJ3114）.