基于麦氏酸活化呋喃的鱼肉新鲜度指示卡研究

    李宁　肖婷　章骞　陈晓梅　陈曦

    

    

    

    摘 要 传统的肉类新鲜度指示卡采用pH型指示剂，受环境因素影响大，容易造成假阳性结果。本研究以麦氏酸活化呋喃 （Meldrum′s activated furan， MAF）为挥发性胺指示剂，聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC）为载体，设计了一种用于检测鱼肉新鲜度的MAF/PVC薄膜。通过旋转涂布法制备薄膜，以NH3为模型物，考察了薄膜的传感性能。结果表明，MAF质量含量为15%、旋转涂布速度为2000 r/min时制得的薄膜对NH3传感效果最好。以MAF/PVC薄膜为新鲜度指示卡，贴于装有鲜鱼肉的托盘包装内。测定MAF/PVC薄膜的亮度（L）、红色度（a）、黄色度（b）值，并根据MAF/PVC薄膜响应前后的L、a、b值计算色差值（ΔE）; 同时，测定鱼肉样品中的总挥发性盐基氮（Total volatile basic nitrogen， TVB-N）含量。结果表明，MAF/PVC薄膜的ΔE值变化趋势与样品中TVB-N含量具有良好的相关性，可准确、快速指示鱼肉的新鲜度，在水产品新鲜度检测中具有良好的应用前景。

    关键词 新鲜度指示卡; 鱼肉; 麦氏酸活化呋喃

    1 引 言

    新鲜度是评价水产品质量的重要指标之一，对水产品品质及原料的加工适性有重要影响。水产品新鲜度评价方法主要包括常规的感官评价法、微生物检测法[1]、高效液相色谱法[2]，以及近年来发展起来的电子鼻[3]、电子舌[4]和高光谱成像法等[5]。但这些方法普遍存在样品前处理过程复杂、操作繁琐、成本高等缺点，难以满足现场快速检测的要求。相比较而言，新鲜度指示器法可以通过直观的颜色变化反映包装内部食品的新鲜程度，是一种小尺寸、低成本的无损检测技术，在水产品新鲜度检测中具有较好的应用潜力[6，7]。

    食品在变质过程中，其蛋白质腐败分解形成氨基酸后，在假单胞菌等的作用下发生脱氨、脱羧反应，产生大量挥发性胺如氨气、三甲胺等，这些胺的存在会使包装空间内pH值上升，研究者据此开发了一系列的新鲜度指示器。Zhang等[8]以洋紫荆花提取的天然染料作为指示剂，实现对猪肉和鱼肉腐败程度的检测。Kuswandi等[9]以甲基红和溴甲酚紫作为指示剂，实现对牛肉新鲜度的检测。Dudnyk等[10]从卷心菜中提取花色苷作为指示剂，设计以果胶为载体的新鲜度传感器，用于检测牛肉和牙鳕的新鲜度。由于这些新鲜度指示器采用的指示剂均为pH敏感型材料，容易受到温度、湿度、干扰气体等环境因素的影响，造成指示剂显色不准确。因此，开发对挥发性胺具有高特异性、灵敏响应的传感材料，是实现准确检测食品新鲜度的重要途径。

    给体-受体斯坦豪斯加合物（Donor-acceptor Stenhouse adducts，DASAs）是一类新颖的光敏感分子，2014年由加州大学圣芭芭拉分校Read de Alaniz课题组首次合成[11]。在长波长光（可见光或近红外光）的作用下，DASAs可发生链状与环状变换，产生新的结构与性质。研究表明，麦氏酸活化的呋喃（Meldrum′s activated furan， MAF）可与胺类化合物发生开环反应，形成高摩尔光吸收的DASAs[12，13]，这为制备鱼肉鲜度标签提供了良好的理论依据。聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC）是一种热塑性材料，具有无毒、重量轻、成本低及加工简单等特性，广泛应用于工业制品、食品包装及化学传感等领域[14～17]。

    本研究以MAF为挥发性胺的指示剂，PVC为载体，通过旋涂法制备MAF/PVC薄膜，以NH3为挥发性胺的模型物，优化了薄膜的制备条件。利用MAF/PVC薄膜对鱼肉新鲜度进行检测，并以样品总挥发性盐基氮（Total volatile basic nitrogen， TVB-N）含量变化趋势为参照，评价薄膜的检测性能，为此薄膜的进一步推广应用提供了实验依据。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    S-4800扫描电子显微镜（日本日立株式会社）; ALPHA II傅立叶红外光谱分析仪（德国布鲁克公司）;? Easycoater 4旋转涂布机（江阴市佳图科技有限公司）; ME 204分析天平（梅特勒-托利多国际贸易有限公司）; 半微量凯氏定氮仪（金坛市晶玻实验仪器厂）; Arium comfort II超纯水系统（赛多利斯科学仪器有限公司）; RE52-AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

    丙二酸环异丙酯（纯度98%）、甲胺（纯度33%）、三甲胺（纯度20%）（美国Sigma-Aldrich公司）; PVC（K-value 72-71）、糠醛（纯度99%）、四氢呋喃（纯度99%）（上海麦克林生化有限公司）; 载玻片（盐城飞舟玻璃有限公司）。 其它溶剂及无机盐均为市售分析纯试剂。白鲫鱼、鲈鱼购于厦门集美农贸市场; 实验用水为超纯水（18.2 MΩ·cm）。

    2.2 实验方法

    2.2.1 MAF的制备 采用一锅法合成MAF[11]。分别称取961 mg丙二酸环异丙酯和1.51 g糠醛，加入纯水中，75℃搅拌2 h，得到黄色沉淀。过滤，收集沉淀，用二氯甲烷溶解。将得到的溶液分别用饱和NaHSO3溶液、水、饱和NaHCO3溶液、饱和NaCl溶液萃取，有机层用无水MgSO4干燥，旋转蒸发除去溶剂，得到亮黄色晶体。

    2.2.2 MAF/PVC薄膜的制备 将0.8 g PVC加入10 mL 四氢呋喃中搅拌至完全溶解，再加入0.5～2.5 g MAF搅拌混匀，制成薄膜前驱液。将载玻片切割成2.5 cm ×2.5 cm的矩形后，分别用乙醇、丙酮和水超声处理30 min，氮气吹干，备用。取600 μL前驱液滴加到處理后的载玻片上，使用旋转涂布机进行涂布，室温干燥后，将MAF/PVC薄膜从载玻片上分离并进行裁剪。

    2.2.3 MAF/PVC薄膜的微观形貌及红外光谱表征 用S-4800型扫描电子显微镜观察MAF/PVC薄膜的表面及横切面结构并拍照，测量前将薄膜真空溅射喷金处理，加速电压为15 kV。

    用ALPHA II型傅立叶红外光谱仪在透射模式下测定指示膜的红外吸收光谱， 扫描范围为550～4000 cm-1，分辨率为2 cm-1，扫描次数为3次。

    2.2.4 MAF/PVC薄膜对NH3的颜色响应 选择NH3作为挥发性胺的模型物。首先，将5 g氨水置于50 mL密闭小瓶中，同时在氨水上方放置棉球，以保持恒定的饱和蒸气压，平衡过夜，得到饱和氨蒸气。其次，将MAF/PVC薄膜置于相同规格的透明小瓶的顶部，再分别向瓶中注入不同浓度的氨蒸气[18]。响应5 min后立即取出薄膜，在恒定照明条件下，使用数码相机捕获薄膜图像。最后，利用Photoshop CS6软件提取薄膜的亮度（L）、红色度（a）、黄色度（b）的数值，并根据MAF/PVC薄膜响应前后的L、a、b值，按照公式（1）计算色差值（ΔE）：

    其中，L1、a1、b1为薄膜响应前的数据，L2、a2、b2为薄膜响应后的数据。

    2.2.5 MAF/PVC薄膜的选择性 将MAF/PVC薄膜分别置于装有甲胺、三甲胺、氨水、乙酸、乙醇和H2S的密闭小瓶中，5 min后取出，记录相关数据。

    2.2.6 MAF/PVC薄膜的稳定性 将薄膜浸没在pH 2.0～12.0的缓冲溶液中，5 min后记录相关数据; 将薄膜置于室温下存储，每隔两天进行一次NH3响应实验，记录相关数据，持续14 d。

    2.2.7 鱼肉样品新鲜度检测 将鲜鱼剔除鱼头、内脏、尾部及鱼鳍部分，再用无菌刀具将鱼肉切成重约30 g的长方体，将样品置于贴有MAF/PVC薄膜的无菌培养皿中。考察薄膜在25℃和4℃对鱼肉的鲜度响应。25℃下每隔12 h，4℃下每隔24 h，提取MAF/PVC薄膜的色差值。同时按照GB/T 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[19]，利用半微量定氮法测定样品的TVB-N含量，平行测定3次。

    3 结果与讨论

    3.1 比色法检测挥发胺的原理

    MAF/PVC薄膜的组装和检测挥发性胺的原理如图1所示。挥发性胺可与包埋在PVC材料中的MAF迅速反应，形成高度着色的DASAs，薄膜的颜色由淡黄色变为紫红色，并且薄膜颜色变化程度与挥发性胺浓度相关，因此，通过裸眼观察或测定MAF/PVC薄膜的色差值ΔE可对挥发性胺的浓度进行定量检测。此外，DASAs虽是光响应染料，但当供体为碱性时（如氨、三甲胺等），染料仅在强非极性基质（如甲苯、三氯甲烷等）中才能漂白[20，21]，因此，本研究所生成的DASAs可以保持稳定的显色。

    3.2 MAF/PVC薄膜的形貌表征

    MAF/PVC薄膜的表面和横截面的扫描电镜图如图2所示。由图2A可见，室温干燥后，薄膜表面平整，说明MAF可以均匀分散到PVC中。薄膜表面分布着较多孔洞，孔径均一，约为2 μm，挥发性胺可通过这些孔洞，与薄膜内的MAF反应，触发显色。由图2B可知，所制得的MAF/PVC薄膜横截面光滑且均匀，表明MAF和PVC之间具有良好的相容性，厚度约为（40±1.2） μm，说明在所选择的涂布条件下，得到的薄膜厚度均匀，这有助于MAF/PVC薄膜显色的均一性。

    3.3 红外光谱分析

    红外光谱可以提供传感膜表面的官能团信息，本研究分别测定了PVC薄膜、MAF以及暴露于NH3前后MAF/PVC薄膜的红外图谱。如图3所示，MAF在1026、1283和1717 cm-1处出现红外吸收峰，对应于COC对称伸缩振动、COC不对称伸缩振动和CO伸缩振动。将MAF包埋在PVC中，制成MAF/PVC薄膜后，薄膜的红外吸收峰分别对应于PVC膜和MAF的特征吸收峰，表明MAF被成功包裹在PVC膜中; 同时，MAF被包埋前、后的红外吸收峰位置未出现偏移，说明MAF分子与PVC之间不是通过化学键合作用连接的，很好地保留了MAF的分子结构，为后续MAF与挥发性胺反应生成DASAs提供了有利条件。比较与NH3反应前、后的MAF/PVC薄膜红外吸收曲线，后者在1190 cm-1出现吸收峰，对应于CN伸缩振动; 在3300～3500 cm-1有一个宽的吸收带，为NH的伸缩振动。这些数据表明，MAF与NH3发生了开环反应，生成了高摩尔吸光系数的DASAs，为后续MAF/PVC薄膜的显色提供了依据。

    3.4 实验条件优化

    3.4.1 MAF浓度的优化 为了简化实验，使用NH3为模型进行探究。考察了前驱液中MAF质量浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%时制得的MAF/PVC薄膜暴露在浓度为76 mg/m3 NH3中的响应结果。在MAF含量较少时，所能形成的DASAs量较少，导致薄膜的颜色变化不明显，ΔE值较小。当MAF质量浓度为时15%，薄膜颜色变化最明显，ΔE=17.62±0.22。继续提高MAF含量，黄色的MAF造成薄膜本底颜色加深，ΔE值下降，且由于PVC含量下降，MAF/PVC薄膜的韧性降低，影响了薄膜的后续使用。因此，本研究选择MAF质量浓度为15%的前驱液。

    3.4.2 旋涂速度的优化 在前驱液中MAF含量相同的情况下，控制旋涂速度分别为1000、1500、2000、2500和3000 r/min，考察所制得的MAF/PVC薄膜的厚度及其对浓度为76 mg/m3 NH3的响应情况。

    如图4所示，旋涂速度为2000 r/min时，制得的薄膜颜色变化最明显，ΔE=17.21±0.21，结合SEM分析，此时薄膜厚度为（40.0±1.7） μm。增大旋涂速度，薄膜的厚度降低，在3000 r/min时，制得的薄膜厚度仅为（17.0±1.8） μm，且薄膜机械强度较低，很难从载玻片上完整剥离，给后续使用带来不便。旋涂速度较低时，涂布机提供的离心力不足以使前驱液均匀分布在载玻片上，导致薄膜各处薄厚不均，影响了薄膜在显色时的均一性，造成ΔE值误差较大。相较而言，转速为2000 r/min時，MAF/PVC薄膜厚度均匀，机械强度较好，且显色最为明显。综合考虑，选择旋涂速度为2000 r/min。

    3.4.3 暴露时间的优化 在MAF的质量浓度为15%，旋涂速度为2000 r/min的条件下，控制MAF/PVC薄膜暴露在NH3浓度为76 mg/m3氛围中的时间分别为3、4、5、6和7 min。随着暴露时间延长，薄膜中的MAF与NH3发生反应，产生的DASAs增多，使得薄膜的颜色变化也随之增大。当暴露时间到达5 min时，薄膜的ΔE=17.22±0.19，继续延长检测时间，MAF/PVC薄膜的颜色变化不明显。因此，本研究选择暴露时间为5 min。

    3.5 MAF/PVC薄膜对NH3的响应曲线

    图5为在前驱液中MAF质量浓度为15%、旋涂速度为2000 r/min的条件下制得的MAF/PVC薄膜暴露于38、76、114、152、190、228、266、304和342 mg/m3的NH3中5 min后的ΔE值。NH3浓度在38～266 mg/m3范围内与MAF/PVC薄膜ΔE值呈良好的线性关系，线性方程为ΔE=0.1478CNH3（mg/m3）- 2.9522 （R2=0.9911），MAF/PVC薄膜可以实现对38～266 mg/m3 NH3的定量检测，对应的MAF/PVC薄膜照片如图5插图所示，随NH3浓度升高，薄膜颜色由浅黄色逐渐变成红色，且薄膜各部分显色均匀，验证了MAF在薄膜中分布均匀且薄膜的厚度均一。此外，根据国际照明委员会（CIE）规定，当ΔE>7时，可认为是人眼可分辨的颜色变化[22]。结合ΔE值和插图中MAF/PVC薄膜的显色照片，可以利用目视法直接评价76～266 mg/m3的NH3含量。

    3.6 MAF/PVC薄膜的选择性

    为了考察MAF/PVC薄膜的选择性，将薄膜分别暴露于甲胺、三甲胺、氨水、乙酸、乙醇和H2S的气体环境中，响应5 min得到薄膜ΔE值，如表1所示。只有当MAF/PVC薄膜暴露在胺类气氛中，其颜色才会发生显著变化，表明此MAF/PVC薄膜具有良好的气体选择性，可用于挥发性胺的检测。

    3.7 MAF/PVC薄膜的稳定性

    考察了pH值及湿度对MAF/PVC薄膜的影响，将薄膜浸没在pH 2.00～12.00的各缓冲溶液中5 min，颜色均未发生变化，表明MAF/PVC薄膜不受pH及湿度的影响。

    为了考察MAF/PVC薄膜的性能稳定性，将薄膜置于室温储存，每隔两天进行一次NH3响应实验，记录相关数据。由图 6可见，在14 d内，MAF/PVC薄膜的ΔE值几乎不变，而在与NH3响应后的各组ΔE值的相对标准偏差为1.6%，表明在14 d内薄膜能保持较好的显色性能。

    3.8 MAF/PVC薄膜在鱼肉新鲜度检测中的应用

    为了研究MAF/PVC薄膜在鱼肉鲜度检测中的应用，将MAF/PVC薄膜固定在无菌培养皿内的顶部，样品置于培养皿内部，分别放置在25℃和4℃下贮藏，记录薄膜的颜色变化，同时测定对应样品的TVB-N含量，结果如图7所示。由图7E和7F可见，贮藏在25℃和4℃的白鲫鱼和鲈鱼的TVB-N含量随贮藏时间延长而呈增长趋势。在贮藏初期（ <24 h）增长缓慢，此时蛋白质未大量分解，鱼肉品质较新鲜，MAF/PVC薄膜的ΔE值变化较小。当贮藏时间超过24 h时，TVB-N的含量急剧上升，说明蛋白质大量分解，鱼肉的变质速率加快，对应的MAF/PVC薄膜颜色逐渐加深（图7A～7D）。贮藏在25℃和4℃下的白鲫鱼的TVB-N含量分别在36和80 h左右达到了国标限定值[23]，此时白鲫鱼不再新鲜，MAF/PVC薄膜对应的ΔE=24.36。贮藏在25℃和4℃下的鲈鱼的TVB-N含量分別在39和81 h达到了国标限定值，ΔE=24.21。MAF/PVC薄膜的ΔE值与鱼肉样品中的TVB-N含量在0.01水平（双侧）上显著相关，拟合曲线如图8所示，线性回归方程为C（TVB-N）=0.823ΔE+0.875（R2=0.996），表明MAF/PVC传感膜在鱼肉新鲜度检测中具有良好的应用潜力。

    4 结 论

    采用PVC薄膜包埋MAF分子，在MAF质量浓度为15%、 旋涂速度为2000 r/min时，制得厚度均匀、表面平整的MAF/PVC薄膜。以MAF/PVC薄膜为NH3指示卡，可以实现对38～266 mg/m3 NH3的定量检测， 同时对挥发性胺有较好的选择性。将MAF/PVC薄膜应用于监测25℃和4℃贮藏条件下白鲫鱼和鲈鱼的新鲜度，鱼肉新鲜时，MAF/PVC薄膜呈黄色; 鱼肉腐败变质时，产生较多挥发性胺，MAF/PVC薄膜呈紫红色。MAF/PVC薄膜色差值变化与鱼肉的TVB-N含量变化具有良好的相关性，可用于鱼肉新鲜度的评价。 MAF/PVC薄膜易制备，成本低，无需专业检测设备，为现场快速检测装置的开发提供了理论依据，在其它高蛋白食品的新鲜度检测中也有很好的应用前景。

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