十元瓜环主客体比率型荧光探针对尼罗替尼的识别和检测

    李孟轩　殷婷　肖尊宏　倪新龙

    

    

    

    摘 要 利用紫外-可见吸收光谱与荧光光谱研究了了十元瓜环（Q[10]）与芘衍生物的主客体作用， 并通过量化理论计算了其超分子组装结构。计算结果表明， 客体中的芘分子以头碰头的形式从Q[10]的两端反方向平行进入其疏水大空腔， 形成2∶1的络合物。等温滴定量热实验结果表明， 系列主客体络合反应是焓变驱动。同时， 利用芘荧光基团的特征单体/二聚体荧光发射构建了基于Q[10]主客体组装的比率型荧光探针， 研究结果表明， 此主客体体系在水溶液中对药物分子尼罗替尼具有较好的选择与识别性能， 并在一定浓度范围内具有良好的线性关系， 检出限为7.05 μmol/L。

    关键词 十元瓜环; 芘类衍生物; 主客体作用; 尼罗替尼; 荧光探针

    1 引 言

    尼洛替尼（NL）是强效精准的第二代酪氨酸激酶抑制剂[1]， 对慢性髓性白血病（CML）患者具有较好的治疗作用。NL在CML患者体内主要通过化学反应代谢为分解产物， 在健康人体内则主要以原药的形式存在[2，3]。理论上， 通过监测CML患者体内NL含量能够对其恢复情况进行有效评估[4，5]。NL的检测方法包括液相色谱-质谱联用法（LC-MS）和高效液相色谱法（HPLC）等方法[6，7]。2016年， Yilmaz等[8]利用反相高效薄层色谱法（RP-HPLC）-荧光检测法测定了血浆、尿液和胶囊中NL的含量。以上仪器方法虽然可以对NL定量检测， 但由于所用仪器比较昂贵、检测成本高， 不利于推广。因此， 开发能够快速、简单、低成本测定NL的方法十分重要。

    基于主客体作用的瓜环荧光探针[9，10]是以瓜环作為受体分子与荧光染料客体通过非共价键作用形成的探针体系， 目标物通过竞争作用取代染料客体分子进入瓜环空腔， 进而改变染料客体分子的荧光发射， 实现目标物质的识别检测。因此， 基于瓜环主客体竞争方法构建的荧光探针具有灵敏度高、选择性好、快速、无损等优点。

    十元瓜环（Q[10]）[11]主要以Q[5]@Q[10]包合物的形式存在， 非常难分离。最近， 研究者发展了一种能够将Q[10]从Q[5]@Q[10]混合物中快速分离的方法[9]。到目前为止， Q[10]是系列瓜环化合物中具有最大空腔的分子[10]， 能包合五元瓜环[11]、金属卟啉[12]、三联吡啶[13]等大尺寸分子[14]。Zhang等[15]利用Q[10]主客体荧光探针实现了Fe3+和Ag+的识别和检测。然而， Q[10]主客体超分子体系作为荧光探针用于分析检测的报道很少。

    目前， 大多数荧光探针主要通过单一的荧光“关闭”-响应或“开启”-响应的方式进行检测[9]， 由于是单一发射峰的变化， 易受仪器效率、光散射以及微环境的影响。相较而言， 比率型荧光探针由于是采用两个不同波长荧光强度的比值进行识别检测， 因此具有灵敏且不易受外界因素干扰的优点[16，17]。芘及其衍生物具有独特的单体荧光发射峰（37 9和393 nm）和二聚体荧光发射峰（480 nm）[18]的光学性质， 被广泛用于荧光传感及分子标记。但是， 目前尚未有利用荧光光谱法直接检测NL的文献报道。本研究以芘染料客体分子与Q[10]形成的超分子体系为比率型荧光探针（图1）， 实现了水溶液中药物分子NL的荧光检测。检测机理是因为两个芘染料基团能够同时被Q[10]空腔容纳， 形成芘的特征二聚体荧光（480 nm）， NL通过竞争作用取代芘客体分子进入Q[10]空腔， 使客体变成游离分子从而产生单体芘分子荧光（379 nm）， 实现比率荧光法检测NL。

    2 实验部分

    2.1 仪器与试剂

    pHS-3C型pH计（瑞士梅特勒-托利多公司）; CaryEclipse荧光光度计（美国瓦里安公司）; Agilent 8453型紫外-可见分光光度计（美国安捷伦公司）; 等温滴定量热仪（美国TA公司）。金刚烷胺（98%）、芘甲醛（98%）、芘甲胺盐酸盐（G1， 95%） 购自上海阿拉丁试剂公司; NL购自南京奇可医药化工有限公司; 磷酸盐缓冲液（PBS）购自上海泰坦公司。实验用水为超纯水。

    2.2 主体Q[10]的合成

    Q[10]是普通瓜环合成中形成的大空腔瓜环（同时生成Q[5]、 Q[6]、 Q[7]、 Q[8]、 Q[10]）， 产率较低，且主要以Q[5]@Q[10]包合物的形式存在[11]。由于Q[5]@Q[10]包合物的结合常数比较大， 所以纯Q[10]分离非常困难。本研究通过加入大量金刚烷胺取代Q[5]@Q[10]包合物中的Q[5]分子， 在水中形成金刚烷胺@Q[10]沉淀， 用DMSO加热回流反复提取Q[10]空腔中的金刚烷胺， 得到高纯度的Q[10]。纯Q[10]的 1H NMR谱图见电子版文后支持信息图S1。 1H NMR（400 MHz， 8 mol/L DCl） δ： 3.41 （d， J = 8.4 Hz， 20H）， 3.28 （s， 20H）， 1.96 （d， J = 8.8 Hz， 20H）。

    2.3 客体G2的合成

    称取200 mg 1-金刚烷胺盐酸盐和1.6 g NaOH加入到圆底烧瓶中， 加入25 mL无水甲醇， 搅拌成均匀的混悬液， 反应1 h， 抽滤， 滤液转移至100 mL圆底烧瓶中。称取230 mg芘甲醛， 加入20 mL无水甲醇溶解， 将所得溶液滴加到烧瓶中， 在61℃下回流12 h， 冷却至室温， 加入500 mg NaBH4， 60℃回流12 h， 冷却至室温， 减压蒸馏， 得到淡黄色固体。固体用20 mL二氯甲烷溶解， 加入20 mL水萃取， 有机相减压蒸馏， 抽滤、 干燥， 得到250 mg淡黄色固体。将此化合物溶于丙酮， 再滴加HCl制成盐酸盐， 最后得到客体G2[19]。1H NMR（400 MHz， D2O） δ： 8.31 （dd. J=13.8， 7.6 Hz， 2H）， 818 （d， J=8.7 Hz， 1H）， 8.13～8.02 （m， 4H）， 7.69 （dd， J=13.6， 8.7 Hz， 2H）， 4.10 （S， 2H）， 220 （S， 3H）， 1.90 （S， 6H）， 1.75 （d， J=12.0 Hz， 3H）， 1.66 （d， J=12.2 Hz， 3H）。

    2.4 吸收光谱与荧光光谱分析

    用PBS缓冲液（pH 2.0）配制1.0×10-5 mol/L Q[10]作为母液， G1和 G2分别配成1.0×10-4 mol/L溶液（pH 2.0）， 用pH=2.0的HCl溶液配制NL母液（1.0× 10-3 mol/L）。在Q[10]/G2溶液中（CQ[10]=5.0×10-6 mol/L， CG2=1.0×10-5 mol/L）滴加NL， 在室温下， 于200～500 nm范围内测定其紫外-可见吸收光谱。同样， 在室温下测定其荧光发射光谱， 激发和发射狭缝宽为5 nm， 激发波长为345 nm， 电压为550 V。

    2.5 NL存在下主客体体系的光谱性质

    将同浓度（1.0× 10-3 mol/L）不同体积（0.0、 3.0、 6.0、 9.0、 12.0、 15.0、 18.0、 21.0、 24.0、 27.0、 30.0、 31.5、 33.0和34.5 μL）的NL溶液（PBS缓冲液， pH 2.0）分别与3.0 mL探针Q[10]/G2主客体组装体的溶液（CQ[10]=5.0×10-6 mol/L， CG2=1.0×10-5 mol/L）混合 （pH 2.0）， 反应10 min后， 测定荧光发射光谱和紫外-可见吸收光谱。以NL浓度（C）为横坐标， 荧光发射强度信号比率（I379 nm/I480 nm）变化量ΔF为纵坐标， 绘制校正曲线， 计算NL的检出限（LOD=3σ/k）。

    2.6 热力学参数分析

    将1.0 ×10-4 mol/L客体溶液置于250 μL进样针内， 在样品池中加1.0×10-5 mol/L Q[10]溶液， 每次滴加12 μL， 时间间隔250 s。采用相同的实验条件， 在25℃下分别测定Q[10]/G1、 Q[10]/G2和Q[10]/NL主客体络合物的热力学参数。

    3 结果与讨论

    3.1 Q[10]与G1、 G2主客体相互作用的光学性质

    在345 nm波长激发下， Q[10]无荧光发射。如图2所示， 质子化的客体分子G1和G2在pH 2.0水溶液中呈现出芘的典型单体荧光发射峰（379和393 nm）， 随着Q[10]主体分子的加入， 此发射峰的强度明显降低， 而在480 nm处芘特征二聚体发射峰的强度逐渐增强， 表明Q[10]与客体发生了络合作用， Q[10]的刚性疏水性大空腔促使客体分子二聚体和该特征发射峰的形成。通过摩尔比法确定了染料客体与Q[10]的作用比， 结果见电子版文后支持信息图S2。当主客体摩尔比约1∶2时， Q[10]/G1与Q[10]/G2在480 nm处的荧光发射强度变化趋于平缓， 表明两个体系都采用摩尔比1∶2 的作用模式。Q[10]/G1与Q[10]/G2主客体作用的紫外-可见吸收光谱（电子版文后支持信息图S3）显示， 随着Q[10]主体分子浓度增加， 客体分子中芘的特征吸收波长的强度明显降低， 同时在354 nm处出现吸收峰， 且随Q[10]主体分子逐渐加入， 此吸收峰明显红移。 上述结果揭示了主客体络合作用， 尤其是Q[10]主体分子的刚性笼体结构使其空腔包结的客体分子间的π-π作用增强， 为芘特征二聚体荧光的形成提供了有力证据。

    3.2 Q[10]与G1和G2的主客体作用模式

    1H NMR（核磁共振）滴定是考察主客体作用模式的有效方法。但是， 由于Q[10]以及与客体分子作用后溶解度较低， 限制了核磁滴定实验的进行。因此， 本研究运用密度泛函理论 （DFT）方法（Gaussian 16）[20]， 在B3LYP[21]水平上使用def-svp2基组[22]， 对Q[10]与G1、 G2的主客体作用模式进行了计算。如图3所示， 在能量最小化结构中， G1和G2中的芘基团以头碰头的方式从Q[10]的两端反方向平行进入其疏水空腔， 形成2∶1的络合物。两个芘荧光基团间的最短距离为0.45 nm， 说明两个芘分子之间可以有效形成π-π作用。计算结果进一步揭示， 在Q[10]/G1中， Q[10]羰基氧与客体分子中的氨基阳离子之间存在氢键作用（键长分别为0.177和0.171 nm）; 同时， G1中的氨基氮正离子与Q[10]端口上的羰基氧之间还存在离子-偶极作用， 键长分别为0.277和0.275 nm。计算结果表明， 在Q[10]/G2体系中， G2分子与Q[10]端口羰基氧形成的氢键键长分别为0.188和0.187 nm， 离子-偶极作用的键长则分别为0.289和0.288 nm。根据计算结果， 可以判断Q[10]/G2络合物的稳定性小于Q[10]/G1。

    3.3 热力学参数分析

    等温滴定量热（ITC）法是超分子主客体化学中热力学研究的常用手段， 该方法主要通过主客体相互作用焓对相关体系的热力学驱动力进行确定。如表1及电子版文后支持信息图S4所示， 在室温（25℃）条件下， 本研究分别对主客体作用体系Q[10]/G1和Q[10]/G2进行ITC滴定， 获得了相关主客体作用的焓变（ΔH）、 络合常数（Ka）、 熵变（TΔS）等热力学数据， 滴定结果表明， Q[10]与G1和G2的摩尔比n均接近2， 由此可知， G1、? G2与Q[10]形成了摩尔比为 2∶1的主客體作用模式， 与荧光发射光谱以及紫外-可见吸收光谱的实验结果一致。在此基础上， 主客体体系的结合平衡常数分别为Ka=（1.45 ± 0.63）×105 L/mol（Q[10]/G1）和（2.24 ± 0.25）× 104 L/mol（Q[10]/G2）， 即Q[10]/G1形成了比Q[10]/G2更稳定的主客体作用， 此数据也与量化计算结果一致。同时， ΔH <0、 TΔS <0， 表明G1、 G2与Q[10]的相互作用主要由主客体间的静电引力即焓驱动[23，24]。

    3.4 主客體荧光探针的检测性能

    进一步研究了Q[10]/G1、 Q[10]/G2作为主客体荧光探针对NL分子的识别性能。如图4A所示， 在pH 2.0 的Q[10]/G2溶液中， 缓慢增加NL分子的浓度， 溶液中的芘二聚体在480 nm发射峰峰强度逐渐减弱， 而芘单体发射峰（379和393 nm）强度则不断增大， 其溶液荧光颜色从绿色转变为天蓝色 （图4A 插图）。这种变化是由于质子化的NL与G2客体产生了竞争作用， 即G2分子被NL挤出Q[10]空腔， 使Q[10]/G2转变为Q[10]/NL主客体络合模式。被挤出的G2分子则以单体分子的方式存在于溶液中， 从而在荧光发射光谱中呈现单体荧光。为进一步探讨Q[10]与NL的作用机制， 通过1H NMR滴定实验研究了NL与Q[10]相互作用情况。如电子版文后支持信息图S5所示， 与Q[10]作用后的NL部分质子峰向高场移动， 说明NL与Q[10]发生了主客体相互作用并进入了Q[10]空腔内（Q[10]空腔的屏蔽作用使质子向高场移动）[12，13]。

    ITC数据表明， NL/Q[10]超分子体系在水溶液中的主客体作用比为2∶1（pH 2.0）， 热力学参数显示， Q[10]/NL的组装主要由主客体之间静电力引起的焓驱动， 说明NL主要以质子化的形式进入Q[10]空腔。Q[10]/NL的络合平衡常数Ka = （1.26 ± 0.32）×105 L/mol， 与Q[10]/G1的Ka相近， 远高于Q[10]/G2体系， 说明在酸性溶液中， 质子化的NL与Q[10]的络合能力大于客体分子G2与Q[10]的结合能力。 因此， 质子化的NL能够通过竞争作用取代G2进入Q[10]空腔， 进而使Q[10]/G2作为探针产生比率型荧光信号（480 nm处的二聚体荧光发射强度降低， 伴随着379 nm处的荧光发射强度上升）， 在1×10-6～5×10-4 mol/L范围内线性关系良好（图5）， 根据荧光滴定的比率信号， NL的检出限（3σ）为 7.1 μmol/L （300 ng/mL）， 虽然高于已报道的LC-MS/MS的检出限（20 ng/mL）[4]， 但是本方法简单、 快速且成本低。

    3.5 Q[10]/G2荧光探针的抗干扰性能

    在含有生物体液中常见离子（Cl-、 Ca2+、 K+、 Fe3+、 Na+、 Zn2+、 H2PO-4、 SO2-4、 NH+4）的Q[10]/G2溶液中（pH 2.0），分别加入NL及其类似物吉非替尼、 拉帕替尼及常见药物赋形剂 （果糖、 葡萄糖、 乳糖、 糊精、 淀粉）， 测定了体系的荧光光谱。如图4B所示，? Q[10]/G2仅对NL具有明显的荧光信号响应， 当上述干扰物质同时存在于NL溶液中时， Q[10]/G2探针溶液的荧光发射强度与波长几乎未发生变化（相对偏差均<5%， 电子版文后支持信息图S6）， 表明Q[10]/G2作为荧光探针对NL具有良好的选择识别性能。

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    Cucurbit[10]uril Host-Guest Based Ratiometric

    Fluorescent Probe for Recognition of Nilotinib

    LI Meng-Xuan1， YIN Ting1， XIAO Zun-Hong*2， NI Xin-Long*1

    1（Key Laboratory of Macrocyclic and Supramolecular Chemistry of Guizhou Province，

    Guizhou University， Guiyang 550025， China）

    2（School of Chemistry and Materials， Guizhou Normal University， Guiyang 550025， China）

    Abstract Host-guest interaction of cucurbit[10]uril （Q[10] or CB[10]） with pyrene-derived derivatives was evaluated by fluorescence emission spectra and UV-vis absorption spectra， and the host-guest binding modes were studied by density functional theory （DFT）. In the energy minimization structures， the pyrene group of the guest was encapsulated in the larger hydrophobic cavity of Q[10] in parallel from the opposite direction in the form of a head-to-head fashion， forming a 2∶1 inclusion. The thermodynamic data indicated that the two host-guest interactions were enthalpy-driven. Furthermore， the Q[10] host-guest interaction of Q[10]/G2 could be used as ratiometric fluorescent probe based on the unique monomer/excimer emission of pyrene moiety on the guest G2. Experiment results indicated that the host-guest interaction derived probe had good recognition and selectivity for nilotinib in aqueous solution， and the detection limit was 7.05 μmol/L.

    Keywords Cucurbit[10]uril; Pyrene-based derivatives; Host-guest interaction; Nilotinib; Fluorescent probe

    （Received 18 February 2020; accepted 28 September 2020）

    This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.21871063） and the Guizhou University （Nos.20175788， 20185781）.

    2020-02-18收稿; 2020-09-28接受

    本文系国家自然科学基金项目（No. 21871063）、 贵州省科学技术基金项目（No. 20165656）和贵州大学自然科学基金项目（Nos. 20175788， 20185781）资助

    * E-mail： xzh729@126.com; longni333@163.com