高效液相色谱法测定食品中罗丹明B含量的不确定度评估

    朱晓雯 付金凤

    

    

    

    摘 要：本试验的目的是建立高效液相色谱法测定罗丹明B的不确定度评估方法，采用食品中罗丹明B经固相萃取、反相色谱柱分离、流动相等度洗脱、外标法定量的方法，依据《测量不确定度评定与表示》考察了称量、标准溶液配制、仪器重复测量等带入的不确定度，并对不确定度的各分量进行计算合成。结果显示，当食品中罗丹明B的含量为0.0052±1.81×10-4mg/kg时，在95%的置信区间下，其扩展不确定度为1.81×10-4mg/kg（k=2）。究其原因，测定过程中的不确定度主要来源于对照品称量、对照品溶液制备及样品定容过程。因此得出结论，本方法对食品中罗丹明B的含量测定具有一定的参考意义。

    关键词：不确定度 ?高效液相色谱法 ?食品 ?罗丹明B

    引言

    罗丹明B（Rhodamine B）是一种具有鲜桃红色的人工合成染料，其在溶液中会发出强烈的荧光，常用于实验室中细胞荧光染色剂、有色玻璃、特色烟花爆竹等行业。罗丹明B曾经被用作食品添加剂，但经实验证明其存在致癌性后，已被禁止用于食品染色。但是，时至今日，仍有一些不法商贩在各种调味料的生产中使用罗丹明B以达到以次充好的目的。

    本研究采用高效液相色谱法[1]对食品中罗丹明B的含量进行测定，并依据《测量不确定度评定与表示》（JJF 1059.1-2012）[2]和《化学分析中不确定度的评估指南》[3]（CNAS-GL06）对食品中罗丹明B检测的不确定度进行测量和分析，以期为食品中罗丹明B的检测提供科学依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料与试剂

    甲醇、乙腈（色谱纯），德国默克公司;罗丹明B对照品（批号510081-201401），中国食品药品检定研究院;供试样品为花椒油（批号：2016.04.08），厂家A。

    1.2 仪器与设备

    岛津高效液相色谱仪LC-20A，日本岛津公司;METTLER XP105电子天平，瑞士梅特勒-托利多集团。

    1.3 实验方法

    1.3.1 色谱条件

    色谱柱：Thermo Syncronis C18（4.6×250mm，5μm）;流动相：0.1%甲酸水溶液︰乙腈（45︰55）;检测器：荧光检测器，激发波长550nm、发射波长580nm;流速：1mL/min;柱温：5℃;进样量：10μL;等度洗脱。

    1.3.2 对照品溶液的制备

    准确称取罗丹明B对照品10mg置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为标准储备液。用移液管精密吸取0.5mL儲备液至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，经0.45μm滤膜过滤，作为标准中间溶液。用含0.1%甲酸的乙腈水溶液将中间标准溶液稀释成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0ng/mL，作为标准工作溶液。

    1.3.3 供试品溶液的制备方法

    称取试样1g（精确到0.01g）置于50mL离心管中，加入10.0mL含0.1%甲酸的甲醇水溶液混匀后于漩涡混匀器上涡旋15min，再于8000r/min离心10min，取3mL提取液层过0.45μm有机相滤膜待净化。将上述提取液1mL移至固相萃取小柱中，加样前先分别用3mL甲醇与水活化，上样后依次用3mL0.1%甲酸水溶液、3mL水、3mL甲醇淋洗固相萃取柱。然后，用6mL氨水甲醇溶液洗脱目标物，收集流出液，在45℃水浴中氮气吹干，用0.5mL0.1%甲酸的乙腈水溶液溶解残渣，通过0.22μm滤膜至进样瓶，作为供试品溶液。

    1.3.4 测定方法

    分别准确吸取标准溶液和试样溶液10μL进样，依据上述色谱条件，以保留时间定性，用外标法计算试样中罗丹明B的含量。

    2 结果与分析

    2.1 测量数学模型的建立

    样品中罗丹明B的含量按照公式计算：

    。

    式中：X为罗丹明B的含量，mg/kg;c为试样中罗丹明B峰面积对应的浓度，ng/mL;V为试样定容体积，mL;m为称样量，g;f为稀释因子。

    2.2 各分量不确定度的来源

    ①标准溶液引入的不确定度：a.标准品称量引入的不确定度u（Wr），b.标准品稀释过程引入的不确定度u（Vr）;②供试品溶液引入的不确定度：a.样品称量引入的不确定度u（Wx），b.样品稀释过程引入的不确定度u（Vx）;③高效液相色谱仪引入的不确定度u（y）;④样品加标回收率重复性实验引入的不确定度u（FRec）。

    2.3 不确定度分量的评定

    2.3.1 样品制备过程引入的不确定度

    2.3.1.1 样品称量过程

    根据天平检定证书，50g内所使用天平的最大允差为±0.0005g，置信区间为95%。称量2次，按正态分布，取，则。样品称量5次，分别为1.0213、1.0225、1.0156、1.0278、1.0106g，

    对应引起的相对标准不确定度分别为：6.92×10-4、6.91×10-4、6.96×10-4、6.88×10-4、7.00×10-4。

    则样品称量引入的合成相对标准不确定度：

    2.3.1.2 样品制备稀释过程中引入的相对标准不确定度

    玻璃仪器在20℃校准，而实验室温度在（20±5）℃范围内波动，水的膨胀系数为2.1×10-4/℃，按均匀分布计算，，溶液温度与校正时温度差引起的水体积不确定度为。

    由于样品制备过程中使用了1、10mL移液管（均为A级），因此按照《常用玻璃仪器检定规程》（JJG 196-2006）[4]的要求，均有相应的允许偏差。按照矩形分布考虑，，由此估算本实验中涉及到的玻璃器皿的相对不确定度分量分别为4.09×10-3、1.30×10-3。

    样品制备过程中稀释因子引入的合成相对标准不确定度为：

    2.3.2 对照品溶液制备过程引入的不确定度

    2.3.2.1 对照品称量过程

    根据天平检定证书，十万分之一天平的最大称量误差为±0.1mg。称量2次，按正态分布，取，则

    ，称取10mg罗丹明B由天平引起的相对标准不确定度为：

    2.3.2.2 对照品制备过程中稀释因子

    对照品溶液制备过程中使用了10、25、50、100mL容量瓶及1mL移液管，均为A级。对照品制备稀释过程中引入与涉及到的玻璃器皿的相对不确定度分量分别为1.30×10-3、6.06×10-4、8.37×10-4、5.80×10-3、4.09×10-3，合成相对标准不确定度为：

    2.3.3 高效液相色谱仪引入的相对标准不确定度

    本研究采用岛津高效液相色谱仪LC-20A进行测定，校准证书上仪器的定量重复性误差为1.1%（n=5），则液相色谱仪的相对标准不确定度为： 。

    2.3.4 样品溶液制备过程中由重复性引起的不确定度及由样品取样量引入的相对标准不确定度

    样品重复测定6次，回收率实验中的回收率分别为89.05%、87.27%、89.56%、86.41%、90.17%、88.26%，平均回收率为88.4%，标准偏差为1.4%，统计结果为正态分布，置信水平95%，其相对标准不确定度为：。式中：s为标准偏差;FRec为平均回收率;n为回收率实验6次。

    2.4 合成相对标准不确定度

    综合上述不确定度分量，则合成相对标准不确定度为：。

    通过实验测得平均加样含量为0.0052mg/kg，合成标准不确定度为0.0052×0.0174=9.05×10-5mg/kg。

    2.5 扩展不确定度

    在95%置信区间下，取包含因子k=2，则扩展不确定度为9.05×10-5×2=1.81×10-4mg/kg，以样品平均含量测得0.0052mg/kg，故本次实验结果的不确定度为0.0052±1.81×10-4mg/kg（k=2）。

    3 结论

    本研究对食品中添加罗丹明B含量检测的不确定度来源进行了较为全面的分析，从研究结果可知，其主要来源为对照品称量、稀释过程及供试品稀释过程引入的不确定度。因此，在实际检测工作中，天平的定期检定与维护保养、玻璃量器的校准，以及实验室温湿度[5]的控制对进一步提高检测结果的准确性和可靠性具有重要意义。

    参考文献：

    [1] BJS 201905《食品中羅丹明B的测定》[Z].

    [2] JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[S].

    [3] 中国合格评定国家认可委员会.化学分析中不确定度的评估指南[M].北京：中国计量出版社，2006.

    [4] JJG 196-2006《常用玻璃量器》[S].

    [5] 朱晓雯，郭芯岐.高效液相色谱法测定减肥类保健食品中酚酞含量的不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2018，9（15）：3954-3957.