饲料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的测定
易建希
摘要：试验建立了饲料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的高效液相色谱测定方法。饲料中的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星用乙腈-磷酸盐缓冲液（pH7.0）提取，混合型阳离子固相萃取柱净化，氨化甲醇溶液洗脱.0.025mol/L磷酸溶液（三乙胺调pH至3.0）：甲醇：乙腈（82：7：11）作为流动相，C18色谱柱进行分离，检测波长为287nm。结果表明，在0.5～50.0μg/mL浓度范围内线性关系良好，r=0.999。该方法的检测限为1.0mg/kg，定量限为5.0mg/kg。本法操作简单，结果准确，可用于饲料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的测定。
关键词：洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星;饲料;高效液相色谱法
1 引言
2015年9月中华人民共和国农业部发布公告决定在食品动物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种兽药（中华人民共和国农业部公告第2292号）。公告内容：为保障动物产品质量安全和公共卫生安全，我部组织开展了部分兽药的安全性评价工作。经评价，认为洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种原料药的各种盐、酯及其各种制剂可能对养殖业、人体健康造成危害或者存在潜在风险。根据《兽药管理条例》第六十九条规定，我部决定在食品动物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种兽药，撤销相关兽药产品批准文号。因此本文建立了高效液相色谱方法对饲料中的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星进行测定。
2材料與方法
2.1试剂与材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。磷酸二氢钾;氢氧化钠;甲醇：色谱纯;乙腈：色谱纯;磷酸：色谱纯;三乙胺：色谱纯;氨水：提取液：磷酸盐缓冲溶液（取磷酸二氢钾6.8g，加水使溶解并稀释至500mL，用5.0mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0）375mL与125mL乙腈混匀;氨水一甲醇溶液：将30mL氨水与70mL甲醇混合均匀;对照品：洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星（纯度≥98%）;对照储备液：精确称取对照品50mg（精确到0.1mg），用0.03mol/L氢氧化钠溶液溶解并稀释，该溶液浓度为1.0mg/mL;对照工作液：准确移取适量对照储备液，用流动相配成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0μg/mL; 0.22μm微孔滤膜;混合型阳离子固相萃取柱（60mg/3 mL）。
2.2仪器与设备
高效液相色谱仪（配有紫外检测器）：分析天平：感量0.00001g和0.001g;固相萃取装置;旋涡混匀器;离心机;恒温振荡器;氮吹仪。
2.3液相色谱条件
检测波长：287nm;色谱柱：C18柱，5μm，250mm*4.6mm;流动相：移取1.7mL磷酸用水稀释至1L，三乙胺调pH至3.0，并按82：7：11的比例和甲醇、乙睛混合，用前超声脱气5min;流速：1.0mL/min;进样量：20μL。
2.4样品前处理
准确称取试样2.0g，置于50mL具塞离心管中，准确加入10.00mL提取液，振荡摇床振荡15 min。置于离心机中15000r/min离心10min，取上清液备用。用3mL甲醇、3mL水活化固相萃取柱，准确移取5.00mL备用液过柱，用3mL水、3mL甲醇淋洗，真空抽干。3mL氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于50℃下氮气吹干。准确移取1.00mL流动相溶解残留物，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供高效液相色谱分析。
2.5标准曲线的绘制
将分别配制为0.5，1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/mL的标准工作液，分别注入色谱仪，测定各浓度工作液的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
2.6灵敏度的测定
称取5份配合饲料各2.0g，按样品处理方法测定，测得基线噪音值，按3倍信噪比计算，求得该方法的检测限。
2.7 回收率的测定
称取空白配合饲料2.0g，分别添加一定量的标准工作液，使得添加浓度分别为1.0，5.0，10.0mg/kg，每一浓度的样品设置5个重复，按样品处理方法测定，用外标法根据峰面积计算其含量和添加同收率。
3结果
空白饲料、阳性添加饲料、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星对照品溶液的液相色谱见
3.1标准曲线
在选定的条件下，做定量校准曲线。以洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的浓度对峰面积绘制标准曲线，结果见表1，表明洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星在0.5～50.0μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。
3.2方法的检测限
该方法测定洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的检测限为1.0 mg/kg，定量限为5.0mg/kg。
4讨论与分析
4.1波长的选择
由洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星在分光光度计的扫描图可知，洛美沙星、氧氟沙星最佳吸收波长为287nm，培氟沙星、诺氟沙星最佳吸收波长为278nm。在278nm波长处洛美沙星、氧氟沙星吸收值与培氟沙星、诺氟沙星吸收值相差较大，而在287nm波长处培氟沙星、诺氟沙星吸收值与洛美沙星、氧氟沙星吸收值相差较小，因此确定最佳检测吸收波长为287nm。
4.2流动相的选择
洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星呈碱性，具有较强的极性，其在反相色谱上保留时间比较好控制。采用反相色谱时有机相的比例对洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的保留影响比较大，选择合适比例的有机溶剂是很必要的。甲醇的洗脱能力低于乙腈，因此选择乙腈作为有机相。随着流动相中乙腈比例的加大，洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的保留时间降低。但单独使用乙腈作为有机相时，等度或梯度流动相中氧氟沙星、诺氟沙星出峰时间重叠，无法分离，所以用部分甲醇代替乙腈，作为有机相组成。为了避开色谱图中氧氟沙星、诺氟沙星峰重叠的干扰，试验比较了多种不同甲醇、乙腈组成比例的色谱图，结果发现采用流动相组分为82%磷酸溶液：7%甲醇：11%乙腈的比例时，可有效洗脱洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星，并分离氧氟沙星、诺氟沙星组份，从综合效率考虑此流动相组成比例为最佳。
4.3提取溶剂的选择
试验中采用了0.1mol/L氢氧化钠溶液.磷酸盐缓冲溶液（pH7.0），0.1mol/L盐酸溶液;0.025mol/L磷酸-三乙胺溶液（pH3.0），等作为提取溶液。通过试验比较各种溶液的回收率，磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）提取液能较好的减少杂质对提取饲料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的影响，但同收率较低。为提高回收率，所以在提取液中加入乙腈，经过比较从5%～50%乙腈比例，得出25%乙腈比例回收率最佳。
4.4净化条件的选择
洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星为碱性化合物，难溶于其他有机溶剂，通过比较HLB、C18、PCX、AluminumN、SCX、MCX、MAX 等固相萃取小柱的回收率和净化效果，最终确定选择回收率高，净化效果好的混合型阳离子固相萃取柱进行净化。
5结论
采用高效液相色谱检测技术测定饲料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星含量的检测方法，在饲料中添加浓度为1.0，5.0，lO.Omg/kg时，测得洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的平均回收率分别为60.0%～95.0%，变异系数分别为1.0%～8.8%，各组分的检测限为1.0mg/kg，定量限为5.0mg/kg。方法具有较好的灵敏度、准确度和精密度，定量限符合相关规定。
高效液相色谱法有“高压、高速、高效、高灵敏度、应用范围广”的特点，最低一级基层实验室均可满足本方法的实验条件，具有很高的推广价值。但由于紫外检测器本身的局限性，导致在检测的过程中，可能存在假阳性的问题，就需要使用更高级的质谱或者串接质谱检测器来做精确辨别。
参考文献（略）
摘要：试验建立了饲料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的高效液相色谱测定方法。饲料中的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星用乙腈-磷酸盐缓冲液（pH7.0）提取，混合型阳离子固相萃取柱净化，氨化甲醇溶液洗脱.0.025mol/L磷酸溶液（三乙胺调pH至3.0）：甲醇：乙腈（82：7：11）作为流动相，C18色谱柱进行分离，检测波长为287nm。结果表明，在0.5～50.0μg/mL浓度范围内线性关系良好，r=0.999。该方法的检测限为1.0mg/kg，定量限为5.0mg/kg。本法操作简单，结果准确，可用于饲料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的测定。
关键词：洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星;饲料;高效液相色谱法
1 引言
2015年9月中华人民共和国农业部发布公告决定在食品动物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种兽药（中华人民共和国农业部公告第2292号）。公告内容：为保障动物产品质量安全和公共卫生安全，我部组织开展了部分兽药的安全性评价工作。经评价，认为洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种原料药的各种盐、酯及其各种制剂可能对养殖业、人体健康造成危害或者存在潜在风险。根据《兽药管理条例》第六十九条规定，我部决定在食品动物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种兽药，撤销相关兽药产品批准文号。因此本文建立了高效液相色谱方法对饲料中的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星进行测定。
2材料與方法
2.1试剂与材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。磷酸二氢钾;氢氧化钠;甲醇：色谱纯;乙腈：色谱纯;磷酸：色谱纯;三乙胺：色谱纯;氨水：提取液：磷酸盐缓冲溶液（取磷酸二氢钾6.8g，加水使溶解并稀释至500mL，用5.0mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0）375mL与125mL乙腈混匀;氨水一甲醇溶液：将30mL氨水与70mL甲醇混合均匀;对照品：洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星（纯度≥98%）;对照储备液：精确称取对照品50mg（精确到0.1mg），用0.03mol/L氢氧化钠溶液溶解并稀释，该溶液浓度为1.0mg/mL;对照工作液：准确移取适量对照储备液，用流动相配成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0μg/mL; 0.22μm微孔滤膜;混合型阳离子固相萃取柱（60mg/3 mL）。
2.2仪器与设备
高效液相色谱仪（配有紫外检测器）：分析天平：感量0.00001g和0.001g;固相萃取装置;旋涡混匀器;离心机;恒温振荡器;氮吹仪。
2.3液相色谱条件
检测波长：287nm;色谱柱：C18柱，5μm，250mm*4.6mm;流动相：移取1.7mL磷酸用水稀释至1L，三乙胺调pH至3.0，并按82：7：11的比例和甲醇、乙睛混合，用前超声脱气5min;流速：1.0mL/min;进样量：20μL。
2.4样品前处理
准确称取试样2.0g，置于50mL具塞离心管中，准确加入10.00mL提取液，振荡摇床振荡15 min。置于离心机中15000r/min离心10min，取上清液备用。用3mL甲醇、3mL水活化固相萃取柱，准确移取5.00mL备用液过柱，用3mL水、3mL甲醇淋洗，真空抽干。3mL氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于50℃下氮气吹干。准确移取1.00mL流动相溶解残留物，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供高效液相色谱分析。
2.5标准曲线的绘制
将分别配制为0.5，1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/mL的标准工作液，分别注入色谱仪，测定各浓度工作液的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
2.6灵敏度的测定
称取5份配合饲料各2.0g，按样品处理方法测定，测得基线噪音值，按3倍信噪比计算，求得该方法的检测限。
2.7 回收率的测定
称取空白配合饲料2.0g，分别添加一定量的标准工作液，使得添加浓度分别为1.0，5.0，10.0mg/kg，每一浓度的样品设置5个重复，按样品处理方法测定，用外标法根据峰面积计算其含量和添加同收率。
3结果
空白饲料、阳性添加饲料、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星对照品溶液的液相色谱见
3.1标准曲线
在选定的条件下，做定量校准曲线。以洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的浓度对峰面积绘制标准曲线，结果见表1，表明洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星在0.5～50.0μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。
3.2方法的检测限
该方法测定洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的检测限为1.0 mg/kg，定量限为5.0mg/kg。
4讨论与分析
4.1波长的选择
由洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星在分光光度计的扫描图可知，洛美沙星、氧氟沙星最佳吸收波长为287nm，培氟沙星、诺氟沙星最佳吸收波长为278nm。在278nm波长处洛美沙星、氧氟沙星吸收值与培氟沙星、诺氟沙星吸收值相差较大，而在287nm波长处培氟沙星、诺氟沙星吸收值与洛美沙星、氧氟沙星吸收值相差较小，因此确定最佳检测吸收波长为287nm。
4.2流动相的选择
洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星呈碱性，具有较强的极性，其在反相色谱上保留时间比较好控制。采用反相色谱时有机相的比例对洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的保留影响比较大，选择合适比例的有机溶剂是很必要的。甲醇的洗脱能力低于乙腈，因此选择乙腈作为有机相。随着流动相中乙腈比例的加大，洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的保留时间降低。但单独使用乙腈作为有机相时，等度或梯度流动相中氧氟沙星、诺氟沙星出峰时间重叠，无法分离，所以用部分甲醇代替乙腈，作为有机相组成。为了避开色谱图中氧氟沙星、诺氟沙星峰重叠的干扰，试验比较了多种不同甲醇、乙腈组成比例的色谱图，结果发现采用流动相组分为82%磷酸溶液：7%甲醇：11%乙腈的比例时，可有效洗脱洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星，并分离氧氟沙星、诺氟沙星组份，从综合效率考虑此流动相组成比例为最佳。
4.3提取溶剂的选择
试验中采用了0.1mol/L氢氧化钠溶液.磷酸盐缓冲溶液（pH7.0），0.1mol/L盐酸溶液;0.025mol/L磷酸-三乙胺溶液（pH3.0），等作为提取溶液。通过试验比较各种溶液的回收率，磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）提取液能较好的减少杂质对提取饲料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的影响，但同收率较低。为提高回收率，所以在提取液中加入乙腈，经过比较从5%～50%乙腈比例，得出25%乙腈比例回收率最佳。
4.4净化条件的选择
洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星为碱性化合物，难溶于其他有机溶剂，通过比较HLB、C18、PCX、AluminumN、SCX、MCX、MAX 等固相萃取小柱的回收率和净化效果，最终确定选择回收率高，净化效果好的混合型阳离子固相萃取柱进行净化。
5结论
采用高效液相色谱检测技术测定饲料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星含量的检测方法，在饲料中添加浓度为1.0，5.0，lO.Omg/kg时，测得洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的平均回收率分别为60.0%～95.0%，变异系数分别为1.0%～8.8%，各组分的检测限为1.0mg/kg，定量限为5.0mg/kg。方法具有较好的灵敏度、准确度和精密度，定量限符合相关规定。
高效液相色谱法有“高压、高速、高效、高灵敏度、应用范围广”的特点，最低一级基层实验室均可满足本方法的实验条件，具有很高的推广价值。但由于紫外检测器本身的局限性，导致在检测的过程中，可能存在假阳性的问题，就需要使用更高级的质谱或者串接质谱检测器来做精确辨别。
参考文献（略）
