8种市售小聚糖酶产品对饲料原料体外酶解的效果比较
崔细鹏 王敏
摘要：为了评价几种单一酶、复合酶对饲料原料的水解效果，进行了体外酶解试验。共采用3种单一酶制剂（木聚糖酶）：酶制剂1号、2、3号;5种复合酶制剂：酶制剂3、4、5、6、7、8号。预试验显示上述酶有基本相似的最适水解反应参数：料水比为1：10、pH5.5、温度37℃和时间5小时。在此参数下，研究添加木聚糖添加量为10U/g饲料原料浓度梯度进行体外酶解。实验结果显示：以还原糖增长率为指标，不同来源的酶，酶解效果差异显著。
关键词：体外酶解;复合酶：酶解效果
在小麦、玉米、豆粕、菜粕等植物性饲料原料中存在着大量的非淀粉多糖（NSP），特別是阿拉伯木聚糖，是重要的抗营养因子。对动物消化吸收存在一定的抗营养作用。众多研究表明，添加木聚糖酶能降解饲粮中的木聚糖、降低食糜黏度、减少微生物的定植、维持肠道正常结构。近年来对木聚糖酶的研究发现，它应用于饲料中提高了饲料营养价值，突破了饲料资源开发利用的局限，增强了动物的生产与抗病能力，减少了动物排泄物造成的污染，作为一种环保添加剂，在发展环保型畜牧业中具有十分重要的意义与价值。目前在酶制剂产品的质量分析方面还没有统一的方法，主要是测定酶的活力。由于酶活测定方法多样且不统一，测定结果很难进行相互间的比较。作为饲用酶制剂，其应用价值受多方面因素的影响，仅靠酶活指标还不能评价酶的质量。在动物日粮中按照设计比例添加木聚糖酶，建立体外酶解评价体系，可以为饲料酶的使用提供试验依据。
1 材料与方法
1.1试剂及仪器
（1）精密pH计（0.01）、分析天平（0.01g）、离心机、分光光度计、恒温振荡水浴锅等。
（2）pH5.5的0.1mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲液。
（3）10%三氯乙酸溶液。
1.2底物制备
实验饲料原料底物包括小麦、豆粕、玉米、米糠粕、黄粉、棉粕、菜粕和麸皮，干燥粉碎过24目。
1.3酶样品来源
本试验采用的木聚糖酶产品来自国内外不同厂家的木聚糖酶产品。表1是这些酶的基本信息。
1.4试验步骤及测定方法
1.4.1实验设计了对照组（不加酶）和加酶组两个处理。
对照组：称取10.00g底物饲料，按料：水=1：10.（水指pH5.5的0.1mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲液）。与酶解样放在一起，酶解开始后，每隔1小时振荡一次，速度120r/min。酶解结束后，加入5ml10%三氯乙酸溶液，取出酶解样品适量4000r/min离心10min，收集上清夜，待测。
加酶组：称取10.00g底物饲料，最终添加木聚糖酶：10U/g原料、50U/g原料、100U/g原料;料：水=1：10（水指pH5.5的0.1mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲液）。酶解温度：37℃，共酶解5个小时，酶解开始后，每隔1小时振荡一次，一次10分钟，速度120r/min。酶解结束后，加入5ml 10%三氯乙酸溶液.取出酶解样品适量4000r/min离心10min，收集上清夜，待测。
1.4.2测定指标
酶解后的样品测定可溶性还原糖含量.采用DNS法测定。
标准曲线制备：配制1mg/ml的标准葡萄糖液，吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8ml，补水至2ml，再加入3，5—二硝基水杨酸溶液1.5ml，沸水显色5min，然后用流水迅速冷却，用水定容至20ml，用振荡器摇匀。以蒸馏水空白调零，在540nm处比色。以OD值为横坐标，还原糖浓度（mg/ml）为总坐标，绘制标准曲线。
样品测定：加入吸取适量的样液，置于25ml容量瓶中，补水补至2ml，再加入3，5—二硝基水杨酸溶液1.5ml，沸水显色5min，然后用流水迅速冷却，用水定容至20ml，用振荡器摇匀。以蒸馏水调零，在540nm处比色，参照葡萄糖标准曲线求出还原糖的含量。
还原糖增长率（%）=（加酶组-对照组）/对照组*100
2结果与讨论
2.1 8种木聚糖酶产品对玉米的体外酶解还原糖增长率（%）见表2
8种酶制剂产品对玉米的还原糖增长率分别为1号（188.5%）、2号（25.50/0）、3号（24.5%）、4号（10.7%）、5号（17.1%）、6号（98.1%）、7号（6.9%）、8号（27.8%）。其中1号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了188.5%：酶解效果较好的是6号，还原糖增长率分别为98.1%：酶解效果最差的是7号仅为6.90%。
2.2 8种木聚糖酶产品对小麦的体外酶解还原糖增长率（%）见表3
8种酶制剂产品对小麦的还原糖增长率分别为1号（254.8%）、2号（101.7%）、3号（86.2%）、4号（32.1%）、5号（64.3%）、6号（118.5%）、7号（13.09%）、8号（l31.9%）。其中1号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了254.8%;酶解效果较好的是2、6、8号，还原糖增长率分别为101.7% /118.5%、131.9%：酶解效果最差的是7号仅为13.09%。
2.3 8种木聚糖酶产品对麸皮的体外酶解还原糖增长率（%）见表4
8种酶制剂产品对麸皮的还原糖增长率分别为1号（75.7%）、2号（55.8%）、3号（75.7%）、4号（33.1%）、5号（49.4%）、6号（83.6%）、7号（24.6%）、8号（40.7%）。其中1、3、6号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了55.8%、49.4%、40.7%;酶解效果较好的是2、5、8号，还原糖增长率分别为101.7%/118.5%、131.9%：酶解效果最差的是7号仅为24.6%。
2.4 8种木聚糖酶产品对黄粉的体外酶解还原糖增长率（%）见表5
8种酶制剂产品对黄粉的还原糖增长率从上表可知：其中1、6号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了56.4%、51.2%：酶解效果较好的是3号，还原糖增长率分别为47.1%：酶解效果最差的是7号仅为11.4%。
2.5 8种木聚糖酶产品对米糠粕的体外酶解还原糖增长率（%）见表6
8種酶制剂产品对米糠粕的还原糖增长率从上表可知：其中1号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了10.3%;酶解效果较好的是5、6号，还原糖增长率分别为6.01%、6.51%：酶解效果最差的是7号，基本无效果。
2.6 8种木聚糖酶产品对豆粕的体外酶解还原糖增长率（%）见表7
8种酶制剂产品对豆粕的还原糖增长率从上表可知：其中8号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了219.0%;酶解效果较好的是1、2、6号，还原糖增长率分别为52.7%、45.6%、48.2%;酶解效果最差的是7号，基本无效果。
2.7 8种木聚糖酶产品对菜粕的体外酶解还原糖增长率（%）见表8
8种酶制剂产品对菜粕的还原糖增长率从上表可知：其中8号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了395.1%：酶解效果较好的是1号，还原糖增长率分别为91.3%;酶解效果最差的是4、7号，还原糖增长率为5.00%。
2.8 8种木聚糖酶产品对棉粕的体外酶解还原糖增长率（%）见表9
8种酶制剂产品对棉粕的还原糖增长率从上表可知：其中3、8号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了120.4%、104.2%：酶解效果较好的是2号，还原糖增长率分别为82.0%：酶解效果最差的是4号，基本无效果。
3 结果分析与讨论
3.1体外法是目前许多企业反映酶制剂作用效果的主要方法，该方法研究省时，省力，省钱，可以快速达到试验目的。该方法除了还原糖的测定以外还包括表观消化率，粘度的测定。虽然与体内的条件差距较大，但是可作为快速评价酶制剂好坏的一种方法。
3.2本试验中涉及到8种酶，其中有4种复合酶（2、4、5、6号），3种单一的木聚糖酶（1、3号）。1个液体发酵木聚糖酶（7号）和1个固体发酵木聚糖酶（8号）。复合酶酶种可能包括有：木聚糖酶、纤维素酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶等等：酶来源可能也不同：有毕赤酵母发酵、细菌性木聚糖酶、曲霉固体发酵所得木聚糖酶等等。1号木聚糖酶对饲料原料酶解效果明显（除了棉粕），3号对棉粕的酶解还原糖增长量达到了120.4%，可能是该酶对棉粕中的木聚糖这种底物具有很强的专一性，能与该酶中的催化域很好的结合。8号对蛋白原料酶解还原糖增长率特别显著。原因可能是因为不同来源的酶由于其空间结构，催化结构域等不同，因此会对不同饲料原料的酶解产生不同的效果。
3.3 DNS体外酶解法是一种快速有效简捷的测定方法，其中有些因素会干扰试验的结果。本试验中酶的稀释浓度对试验结果影响较大。当D540>0.5时，得到的降解率结果偏低：当OD540<0.2时，得到的降解率结果偏高：当0.2
参考文献（略）
摘要：为了评价几种单一酶、复合酶对饲料原料的水解效果，进行了体外酶解试验。共采用3种单一酶制剂（木聚糖酶）：酶制剂1号、2、3号;5种复合酶制剂：酶制剂3、4、5、6、7、8号。预试验显示上述酶有基本相似的最适水解反应参数：料水比为1：10、pH5.5、温度37℃和时间5小时。在此参数下，研究添加木聚糖添加量为10U/g饲料原料浓度梯度进行体外酶解。实验结果显示：以还原糖增长率为指标，不同来源的酶，酶解效果差异显著。
关键词：体外酶解;复合酶：酶解效果
在小麦、玉米、豆粕、菜粕等植物性饲料原料中存在着大量的非淀粉多糖（NSP），特別是阿拉伯木聚糖，是重要的抗营养因子。对动物消化吸收存在一定的抗营养作用。众多研究表明，添加木聚糖酶能降解饲粮中的木聚糖、降低食糜黏度、减少微生物的定植、维持肠道正常结构。近年来对木聚糖酶的研究发现，它应用于饲料中提高了饲料营养价值，突破了饲料资源开发利用的局限，增强了动物的生产与抗病能力，减少了动物排泄物造成的污染，作为一种环保添加剂，在发展环保型畜牧业中具有十分重要的意义与价值。目前在酶制剂产品的质量分析方面还没有统一的方法，主要是测定酶的活力。由于酶活测定方法多样且不统一，测定结果很难进行相互间的比较。作为饲用酶制剂，其应用价值受多方面因素的影响，仅靠酶活指标还不能评价酶的质量。在动物日粮中按照设计比例添加木聚糖酶，建立体外酶解评价体系，可以为饲料酶的使用提供试验依据。
1 材料与方法
1.1试剂及仪器
（1）精密pH计（0.01）、分析天平（0.01g）、离心机、分光光度计、恒温振荡水浴锅等。
（2）pH5.5的0.1mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲液。
（3）10%三氯乙酸溶液。
1.2底物制备
实验饲料原料底物包括小麦、豆粕、玉米、米糠粕、黄粉、棉粕、菜粕和麸皮，干燥粉碎过24目。
1.3酶样品来源
本试验采用的木聚糖酶产品来自国内外不同厂家的木聚糖酶产品。表1是这些酶的基本信息。
1.4试验步骤及测定方法
1.4.1实验设计了对照组（不加酶）和加酶组两个处理。
对照组：称取10.00g底物饲料，按料：水=1：10.（水指pH5.5的0.1mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲液）。与酶解样放在一起，酶解开始后，每隔1小时振荡一次，速度120r/min。酶解结束后，加入5ml10%三氯乙酸溶液，取出酶解样品适量4000r/min离心10min，收集上清夜，待测。
加酶组：称取10.00g底物饲料，最终添加木聚糖酶：10U/g原料、50U/g原料、100U/g原料;料：水=1：10（水指pH5.5的0.1mol/l的乙酸-乙酸钠缓冲液）。酶解温度：37℃，共酶解5个小时，酶解开始后，每隔1小时振荡一次，一次10分钟，速度120r/min。酶解结束后，加入5ml 10%三氯乙酸溶液.取出酶解样品适量4000r/min离心10min，收集上清夜，待测。
1.4.2测定指标
酶解后的样品测定可溶性还原糖含量.采用DNS法测定。
标准曲线制备：配制1mg/ml的标准葡萄糖液，吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8ml，补水至2ml，再加入3，5—二硝基水杨酸溶液1.5ml，沸水显色5min，然后用流水迅速冷却，用水定容至20ml，用振荡器摇匀。以蒸馏水空白调零，在540nm处比色。以OD值为横坐标，还原糖浓度（mg/ml）为总坐标，绘制标准曲线。
样品测定：加入吸取适量的样液，置于25ml容量瓶中，补水补至2ml，再加入3，5—二硝基水杨酸溶液1.5ml，沸水显色5min，然后用流水迅速冷却，用水定容至20ml，用振荡器摇匀。以蒸馏水调零，在540nm处比色，参照葡萄糖标准曲线求出还原糖的含量。
还原糖增长率（%）=（加酶组-对照组）/对照组*100
2结果与讨论
2.1 8种木聚糖酶产品对玉米的体外酶解还原糖增长率（%）见表2
8种酶制剂产品对玉米的还原糖增长率分别为1号（188.5%）、2号（25.50/0）、3号（24.5%）、4号（10.7%）、5号（17.1%）、6号（98.1%）、7号（6.9%）、8号（27.8%）。其中1号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了188.5%：酶解效果较好的是6号，还原糖增长率分别为98.1%：酶解效果最差的是7号仅为6.90%。
2.2 8种木聚糖酶产品对小麦的体外酶解还原糖增长率（%）见表3
8种酶制剂产品对小麦的还原糖增长率分别为1号（254.8%）、2号（101.7%）、3号（86.2%）、4号（32.1%）、5号（64.3%）、6号（118.5%）、7号（13.09%）、8号（l31.9%）。其中1号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了254.8%;酶解效果较好的是2、6、8号，还原糖增长率分别为101.7% /118.5%、131.9%：酶解效果最差的是7号仅为13.09%。
2.3 8种木聚糖酶产品对麸皮的体外酶解还原糖增长率（%）见表4
8种酶制剂产品对麸皮的还原糖增长率分别为1号（75.7%）、2号（55.8%）、3号（75.7%）、4号（33.1%）、5号（49.4%）、6号（83.6%）、7号（24.6%）、8号（40.7%）。其中1、3、6号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了55.8%、49.4%、40.7%;酶解效果较好的是2、5、8号，还原糖增长率分别为101.7%/118.5%、131.9%：酶解效果最差的是7号仅为24.6%。
2.4 8种木聚糖酶产品对黄粉的体外酶解还原糖增长率（%）见表5
8种酶制剂产品对黄粉的还原糖增长率从上表可知：其中1、6号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了56.4%、51.2%：酶解效果较好的是3号，还原糖增长率分别为47.1%：酶解效果最差的是7号仅为11.4%。
2.5 8种木聚糖酶产品对米糠粕的体外酶解还原糖增长率（%）见表6
8種酶制剂产品对米糠粕的还原糖增长率从上表可知：其中1号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了10.3%;酶解效果较好的是5、6号，还原糖增长率分别为6.01%、6.51%：酶解效果最差的是7号，基本无效果。
2.6 8种木聚糖酶产品对豆粕的体外酶解还原糖增长率（%）见表7
8种酶制剂产品对豆粕的还原糖增长率从上表可知：其中8号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了219.0%;酶解效果较好的是1、2、6号，还原糖增长率分别为52.7%、45.6%、48.2%;酶解效果最差的是7号，基本无效果。
2.7 8种木聚糖酶产品对菜粕的体外酶解还原糖增长率（%）见表8
8种酶制剂产品对菜粕的还原糖增长率从上表可知：其中8号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了395.1%：酶解效果较好的是1号，还原糖增长率分别为91.3%;酶解效果最差的是4、7号，还原糖增长率为5.00%。
2.8 8种木聚糖酶产品对棉粕的体外酶解还原糖增长率（%）见表9
8种酶制剂产品对棉粕的还原糖增长率从上表可知：其中3、8号的酶解效果最好，还原糖增长率达到了120.4%、104.2%：酶解效果较好的是2号，还原糖增长率分别为82.0%：酶解效果最差的是4号，基本无效果。
3 结果分析与讨论
3.1体外法是目前许多企业反映酶制剂作用效果的主要方法，该方法研究省时，省力，省钱，可以快速达到试验目的。该方法除了还原糖的测定以外还包括表观消化率，粘度的测定。虽然与体内的条件差距较大，但是可作为快速评价酶制剂好坏的一种方法。
3.2本试验中涉及到8种酶，其中有4种复合酶（2、4、5、6号），3种单一的木聚糖酶（1、3号）。1个液体发酵木聚糖酶（7号）和1个固体发酵木聚糖酶（8号）。复合酶酶种可能包括有：木聚糖酶、纤维素酶、酸性蛋白酶、α-淀粉酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶等等：酶来源可能也不同：有毕赤酵母发酵、细菌性木聚糖酶、曲霉固体发酵所得木聚糖酶等等。1号木聚糖酶对饲料原料酶解效果明显（除了棉粕），3号对棉粕的酶解还原糖增长量达到了120.4%，可能是该酶对棉粕中的木聚糖这种底物具有很强的专一性，能与该酶中的催化域很好的结合。8号对蛋白原料酶解还原糖增长率特别显著。原因可能是因为不同来源的酶由于其空间结构，催化结构域等不同，因此会对不同饲料原料的酶解产生不同的效果。
3.3 DNS体外酶解法是一种快速有效简捷的测定方法，其中有些因素会干扰试验的结果。本试验中酶的稀释浓度对试验结果影响较大。当D540>0.5时，得到的降解率结果偏低：当OD540<0.2时，得到的降解率结果偏高：当0.2
参考文献（略）
