三七通舒胶囊联合丁苯酞治疗脑梗死的通用分子机制研究

    陈瑶 周德生 颜思阳

    

    

    

    摘要 目的：采用生物信息学方法，分析脑梗死气虚血瘀证、阴虚血瘀证证型相关特异性基因及共性基因，并对三七通舒胶囊联合丁苯酞治疗脑梗死血瘀证的通用分子机制进行探讨，为中西医结合防治脑梗死提供理论依据。方法：分析GEO芯片数据，筛选获得脑梗死气虚血瘀证、阴虚血瘀证差异基因，将2种血瘀证差异基因取交集得证型相关特异性基因与血瘀证共性基因3个子集。从蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）共表达网络、基因本体（GO）及京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析角度，探讨2种血瘀证特异基因的作用异同。筛选三七通舒胶囊联合丁苯酞活性成分靶点与血瘀证共性基因整合，获得“药物-疾病-证型”共同靶点，拓扑分析聚焦核心靶点并行分子对接，并构建共同靶点PPI网络并行富集分析，探讨三七通舒胶囊联合丁苯酞治疗脑梗死血瘀证的作用机制。结果：获取脑梗死气虚血瘀证差异基因2 092个、阴虚血瘀证差异基因2 160个，其中气虚血瘀证特异基因422个、阴虚血瘀证特异基因490个及血瘀证共性基因1 670个。其中气虚血瘀证、阴虚血瘀证差异基因均通过多组分、多功能、多途径发挥作用，但气虚血瘀证中MMP-9、EIF4A3等靶点相互作用最强，主要通过T细胞受体信号通路等发挥作用;阴虚血瘀证中EGFR、STAT3等靶点相互作用最强，并通过ErbB信号通路发挥作用。筛选获得274个药物靶点，整合血瘀证共性基因后得32个共同靶点，拓扑分析后聚焦核心靶点SRC，分子对接发现氢键连接、混合Pi键连接和疏水作用可能是主要作用形式。三七通舒胶囊联合丁苯酞以多组分、多功能、多途径的形式介导趋化因子信号通路，cAMP信号通路等在脑梗死血瘀证中发挥作用。结论：2种血瘀证证型相关特异基因分析揭示了证型富集特点，为证型相关研究提供依據。“药物-疾病-证型”共同靶点的分析结果揭示了三七通舒胶囊联合丁苯酞治疗脑梗死血瘀证可能的通用分子机制。为中西医结合治疗脑梗死提供依据。

    关键词 三七通舒胶囊;丁苯酞;脑梗死;网络药理学;分子对接

    Abstract Objective：To analyze the specific and common genes related to qi deficiency and blood stasis syndrome and yin deficiency and blood stasis syndrome of cerebral infarction by bioinformatics method，and to explore the mechanism of Sanqi Tongshu Capsule combined with butylphthalide in the treatment of blood stasis syndrome of cerebral infarction in order to provide theoretical basis for the prevention and treatment of cerebral infarction with combination of traditional Chinese and Western medicine.Methods：GEO chip data was analyzed，differential genes of qi deficiency and blood stasis syndrome was obtained and screened.From the perspective of PPI co-expression network，GO and KEGG enrichment analysis，the similarities and differences of the 2 blood stasis syndrome-specific genes were discussed.Sanqi Tongshu Capsules combined with butylphthalide active ingredient targets and blood stasis syndrome common gene integration was screened，and a common target of “drug-disease-syndrome” was obtained.Topological analysis focusing on core targets and parallel molecular docking，and common targets PPI network parallel enrichment analysis was constructed to explore the mechanism of Sanqitongshu Capsule combined with butylphthalide in the treatment of cerebral infarction with blood stasis syndrome.Results：A total of 2 092 differential genes of qi deficiency and blood stasis syndrome and 2 160 differential genes of yin deficiency and blood stasis syndrome of cerebral infarction were obtained，including 422 specific genes of qi deficiency and blood stasis syndrome，490 specific genes of yin deficiency and blood stasis syndrome and 1 670 common genes of blood stasis syndrome.Among them，there were 422 specific genes for qi deficiency and blood stasis syndrome，490 specific genes for Yin deficiency and blood stasis syndrome，and 1 670 common genes for blood stasis syndrome.Among them，the differential genes of qi deficiency and blood stasis syndrome and yin deficiency and blood stasis syndrome play a role through multi-component，multi-function，and multiple pathways.However，targets such as MMP-9 and EIF4A3 in qi deficiency and blood stasis syndrome have the strongest interaction，mainly through T cell receptors.In yin deficiency and blood stasis syndrome，EGFR，STAT3 and other targets have the strongest interaction，and they play a role through the ErbB signaling pathway.A total of 274 drug targets were screened and 32 common targets were obtained after integration of the common genes of blood stasis syndrome.After topological analysis，the core target SRC was focused.Hydrogen bond connection，mixed Pi bond connection and hydrophobic interaction were found to be the main action forms in molecular docking.The enrichment results of GO and KEGG showed that Sanqi Tongshu Capsule combined with butylphthalide mediated chemokine signaling pathway and cAMP signaling pathway in the form of multi-component，multi-function and multi-pathway in the blood stasis syndrome of cerebral infarction.Conclusion：The analysis of specific genes related to the 2 types of blood stasis syndrome reveals the enrichment characteristics of syndrome types and provides a basis for the related research of syndrome types.The analysis of the common target of “drug-disease-syndrome” reveals the possible general mechanism of Sanqi Tongshu Capsule combined with butylphthalide in the treatment of blood stasis syndrome of cerebral infarction，which provides basis for the treatment of cerebral infarction with the combination of traditional Chinese medicine and Western medicine.

    Keywords Sanqi Tongshu Capsule; Butylphthalide; Cerebral infarction; Network pharmacology; Molecular docking

    中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.006

    脑梗死是一种神经内科常见病、多发病，具有高病死率、致残率的特点[1-2]。超早期溶栓或桥接机械取栓是目前治疗脑梗死最为有效的手段，但严格的时间窗限制了溶栓比率，出血转化限制了治疗效果，故积极恢复脑循环，缩小缺血区域，改善神经功能是亟待解决的临床问题，而中西医结合防治策略具有重要意义[3]。中国脑梗死中西医结合诊治指南指出中西医应当结合治疗，互相补充，且在辨证的基础上活血通络应贯穿于治疗的始终[4]。急性缺血性卒中指南指出丁苯酞目前是国内改善脑血循环的主要药物之一，但丁苯酞以化学单体为有效成分，作用靶点较为单一，而三七通舒胶囊作为活血化瘀中成药制剂之一，具有多种成分，可通过多靶点发挥作用，二者联合应用具有协同治疗、增加作用靶点的特点，二者临床常联合使用治疗脑梗死[3]。本研究从生物信息学出发，整合多个数据库，分析脑梗死气虚血瘀证、阴虚血瘀证差异基因，探讨证型相关特异基因的异同，并对三七通舒胶囊联合丁苯酞治疗脑梗死血瘀证通用分子机制进行探讨，为中西医结合防治脑梗死提供理论和实践依据。

    1 材料与方法

    1.1 脑梗死气虚血瘀证与阴虚血瘀证差异基因（DEGs）的筛选 利用GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“cerebral infarction”OR“Blood Stasis”为检索词，获取GSE100235数据集，数据集中各模型组均为再灌注24 h后取材，考虑为脑梗死早期。包括有假手术组（Sham组）：GSM2675543、GSM2675544、GSM2675545;气虚血瘀模型组（QDBS组）：GSM2675543、GSM2675544、GSM2675545;阴虚血瘀模型组（YDBS组）：即GSM2675546、GSM2675547、GSM2675548。

    利用R语言分别对QDBS组（3组）和Sham组、YDBS组（3组）和Sham组数据表达矩阵进行质量控制，绘制箱式图及主成分分析图;并采用limma包对表达矩阵进行差异性分析，以|logFC|≥1与adj.P.Val<0.05为筛选条件，分别筛选出脑梗死气虚血瘀证与阴虚血瘀证DEGs，绘制火山图及前50位热图。

    进一步将脑梗死气虚血瘀证与阴虚血瘀证DEGs取交集，获得气虚血瘀证、阴虚血瘀证证型相关特异基因与血瘀证共性基因3个子集，并利用韦恩图将结果可视化。

    1.2 2种血瘀证证型相关特异性基因分析 利用String功能蛋白关联数据库，设定“Multiple proteins”模式，分别导入脑梗死阴虚血瘀证、气虚血瘀证证型相关特异基因，物种选定“Homo sapiens”，余均为默认设置，获取蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）相关信息[5]。利用Cytoscape对PPI网络进行可视化，采用Cytoscape cytoHubba对PPI进行Degree、Betweenness、Closeness算法拓扑分析，篩选出各算法前10位差异基因。同时利用DAVID数据库，分别对2种证型特异基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）及京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集。以“OFFICIAL GENE SYMBOL”格式导入，设定“Background”为“Homo sapiens”，设定P<0.05，分别导出细胞组分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）、生物过程（Biological Process，BP）和KEGG通路富集，对P值取负对数，得出“-lgP”，P值越小，-lgP值越大，富集程度越大，并按-lgP排序，利用R语言ggplot2软件包对前10位进行可视化。

    1.3 潜在药物靶点预测与脑梗死血瘀证共性基因共同靶点的筛选 药物有效成分及结构式的收集：1）三七通舒胶囊为三七三醇皂苷制剂，主要活性成分为三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、三七皂苷Re[6];丁苯酞有效成分为消旋-3-正丁基苯酞。2）采用PubChem[7]（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库收集各有效成分SDF结构式。潜在药物靶点收集：将有效成分结构式导入Swiss Target Prediction[5]（http：//www.swisstargetprediction.ch/）数据库，获取三七通舒胶囊联合丁苯酞潜在药物靶点。

    将潜在药物靶点与脑梗死血瘀证共性基因取交集，获得三七通舒胶囊联合丁苯酞治疗脑梗死血瘀证可能作用的共同靶点，并利用韦恩图将结果可视化。

    1.4 共同靶点PPI网络构建及拓扑分析 将共同靶点导入String数据库获取PPI相关信息，并利用Cytoscape对PPI信息进行可视化。利用Network analyzer对PPI进行拓扑分析，根据Degree值筛选。同时利用cytoHubba插件进行Degree、Betweenness、Closeness拓扑分析获取前10位靶点，筛选药物作用核心靶点。

    1.5 共同靶点GO和KEGG富集分析 利用DAVID数据库，对共同靶点进行GO富集与KEGG通路富集分析。设定P<0.05，分别导出CC、MF、BP和KEGG通路富集，对P值取负对数，得出“-lgP”，并按-lgP排序，利用R语言ggplot2软件包对前10位进行可视化。

    1.6 分子对接模拟 将1.3中获得的药物主要活性成分导入Chem3D进行优化;将1.4项下筛选出的核心蛋白靶点通过PDB[8]（https：//www.rcsb.org/）数据库，选择最佳蛋白晶体结构并下载其“PDB”格式文件。AutoDock Tools对活性成分进行预处理，使能量最小化。Discovery Studio对蛋白进行除水、加氢并预测对接活性位点，获得配置参数坐标。利用AutoDock Vina将活性成分分别与核心蛋白对接。PyMOL、Discovery Studio软件对对接结果进行可视化分析。

    2 结果

    2.1 脑梗死气虚血瘀证与阴虚血瘀证差异基因（DEGs）筛选结果 利用GEO数据库，获取GSE100235数据集，采用R语言limma包分别对QDBS-Sham组、YDBS-Sham组数据进行归一化与差异分析，并分别绘制QDBS-Sham组与YDBS-Sham组箱式图（图1A、图1B）、主成分分析（PCA）图（图1C、图1D）、差异基因火山图（图2A、图2B）及前50位差异基因热图（图3A、图3B）。

    归一化、主成分分析结果显示QDBS-Sham组、YDBS-Sham组各数据均处于同一数量级，可进行综合分析。火山图、热图结果显示：脑梗死气虚血瘀证差异基因共2 092个，其中1 825个表达上调，267个表达下调;阴虚血瘀证差异基因共2 160个，其中1 985个差异基因表达上调，175个差异基因表达下调。

    进一步对脑梗死气虚血瘀证、阴虚血瘀证差异基因取交集，并利用韦恩图将结果可视化见图4A、图4B，其中有1 552个差异基因在2种证型中均表达上调（如JAK2、CASP3、CXCR5等），脑梗死气虚血瘀证特异性上调基因273个（如EIF2AK3、CCR9等）、阴虚血瘀证特异性上调基因433个;118个差异基因在2种证型中均表达下调，149个气虚血瘀证特异性下调基因，57个阴虚血瘀证特异性下调基因。综合可得3个子集，即脑梗死气虚血瘀证特异基因（422个）、阴虚血瘀证特异基因（490个）及血瘀证共性基因（1 670个）。

    2.2 脑梗死2种血瘀证证型相关特异基因富集分析结果 通过String数据库和Cytoscape软件分别对脑梗死气虚血瘀证、阴虚血瘀证特异基因进行Degree、Betweenness、Closeness算法拓扑分析，分别筛选出各算法前10位基因。见表1～2。其中气虚血瘀特异基因主要聚集在CCT7、MMP-9、EIF4A3等，阴虚血瘀特异基因主要聚集在EGFR、STAT3、ITGAM等。

    GO和KEGG富集结果表明：气虚血瘀证特异基因主要分布于膜、核质、外泌体、核仁、细胞质、转录因子复合体等细胞组分，通过蛋白质结合、ATP依赖性解旋酶活性、凝血酶受体活性、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合等，调控血小板活化、DNA修复、rRNA加工、免疫反應、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录调控等生物途径，通过T细胞受体信号通路、RNA转运、血小板活化、泛素介导的蛋白水解等信号通路发挥作用。阴虚血瘀证差异基因主要分布于细胞外泌体、胞质溶胶、高尔基体、核膜、内质网、吞噬溶酶体等，通过蛋白质结合、蛋白质复合物结合、受体活性、微管结合等，调控炎症反应、凋亡过程、信号传导、趋化性、免疫反应、白细胞迁移等生物过程，主要富集于Toll样受体信号通路、造血细胞谱系、ErbB信号通路等发挥作用。利用R语言ggplot2软件包，按-lgP排序，将2组前10位结果可视化。见图5A、图5B、图6A、图6B。

    2.3 潜在药物靶点与脑梗死血瘀证共性基因共同靶点筛选结果 通过文献挖掘，收集三七通舒胶囊、丁苯酞主要活性成分4个，利用Pubchem数据库获得其结构式，通过Swiss Target Prediction数据库对活性成分相关靶点进行预测，得到三七通舒胶囊联合丁苯酞274个潜在靶点，其中丁苯酞108个，三七通舒胶囊175个靶点。

    将药物靶点与脑梗死血瘀证共性基因取交集，获得三七通舒胶囊联合丁苯酞治疗脑梗死血瘀证靶点32个，并利用韦恩图将结果可视化。见图7，具体靶点见表3。

    2.4 共同靶点蛋白PPI网络构建 利用String数据库及Cytoscape软件对共同靶点进行PPI分析，得出PPI网络图。设定1≤Degree值<5为绿色，5≤Degree值<10为粉色，Degree值≥10为大红色。见图8。该网络图中共有31个靶点（PLA2G7无相互作用），其中CASP3（Degree值=15），SRC（Degree值=13），NR3C1（Degree值=10）等，表明三七通舒胶囊联合丁苯酞可通过多个作用靶点在脑梗死中发挥作用。

    进一步利用Cytoscape中cytoHubba插件进行Degree、Closeness、Betweenness算法拓扑分析，筛选出各算法前10位差异基因。见表4。根据拓扑分析结果，明确共同靶点核心基因为CASP3、SRC、NR3C1，与Degree值分析结果一致。

    2.5 共同靶点GO和KEGG富集分析 利用DAVID数据库，对32个共同靶点进行GO及KEGG富集分析，共富集92个BP、17个CC、26个MF以及69个KEGG通路。对P值取负对数，筛选出富集程度前10位进行分析，可视化见图9A、图9B。GO富集结果显示，共同靶点主要分布于细胞表面、胞质溶胶、质膜、神经元投射、磷脂酰肌醇-3-激酶复合物、细胞质等细胞成分中，通过调节多种激酶（如蛋白激酶、氨肽酶、磷脂酰肌醇-3-激酶）的活性、激酶结合、蛋白质结合等方式，参与血管内皮生长因子受体信号通路、白细胞迁移、蛋白质磷酸化、磷脂酰肌醇介导的信号传导、血小板活化等生物过程。而这些生物过程主要通过趋化因子信号通路、cAMP信号通路等发挥作用。提示三七通舒胶囊联合丁苯酞可通过多细胞组分、多途径参与多种生物过程，并富集于多种通路治疗脑梗死血瘀证。

    2.6 分子对接模拟结果 共同靶点拓扑分析结果表明，核心基因主要为CASP3、SRC等，结合KEGG富集结果，CASP3主要富集通路与肿瘤相关，与本研究所探讨的内容无关，且CASP3常作为下游效应蛋白发挥作用，故暂不将其列为核心基因。而KEGG富集结果表明，SRC主要通过参与趋化因子信号通路在脑梗死中发挥调控作用。SRC原癌基因为非受体酪氨酸激酶，其主要磷酸化位点包括一个由相邻SRC分子在激酶域中磷酸化产生的pTyr419激活性位点和由C端SRC激酶（CSK）或CSK同源激酶（CHK）产生的pTyr530抑制性位点[9]。研究表明，SRC抑制剂在缺血性脑损伤早期有效[10-11]，抑制SRC不会影响中风后急性的脑血流量或缺血半球的灌注[11]，且在脑梗死早期，活化的SRC激酶可通过上调VEGFA的产生，加重缺血后的血脑屏障渗漏[12]。所以在脑梗死早期应当抑制SRC激酶的磷酸化，减轻血脑屏障的破坏，以保护神经功能。所以脑梗死急性期治疗药物应当作用于SRC的C端抑制性位点。

    在PDB官网中获取c-SRC结构式，利用AutoDock vina分别将丁苯酞、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、三七皂苷Re与其进行分子对接模拟，利用PyMOL、Discovery Studio软件对结果进行可视化。见图10。分子对接模拟结果表明，丁苯酞与三七通舒胶囊活性成分主要通过氢键、烷基疏水键、混合Pi/烷基疏水键等与c-SRC相结合。

    3 讨论

    脑梗死属于中医“缺血中风”范畴，为神经内科常见病，因其起病急骤，病情变化迅速凶险，通常遗留后遗症，不仅给患者身心健康造成威胁，且增加了医疗负担。中医学对于中风的认识可追溯至《黄帝内经》，如《素问·生气通天论》曰“阳气者，大怒则形气绝，而血菀于上，使人薄厥”;《素问·调经论》云：“血之与气并走于上，则为大厥。”而历代医家对于中风的认识颇多，现认为其主要为虚（阴虚、气虚）、火（肝火、心火）、风（肝风、外风）、痰（风痰、湿痰）、气（气逆）、血（血瘀）六端，而虚、火、风、痰、气五端可导致气机无力或逆乱，血行停滞或瘀阻，进而形成病理产物之瘀血阻滞脑脉脑络，可见瘀为最终形成缺血中风的核心。脑络瘀阻，则清阳不升，脑髓失于充养，元神失司，则见猝然昏仆，不省人事等;脉中瘀阻，则肢体缺于濡养、半身不遂、口眼歪斜等症可见。而又以阴虚、气虚最为根本，阴虚则或血化无源，或血液黏滞，气虚则血行无力，气血失和。故血瘀是缺血中风发病的关键因素，而又以气虚血瘀、阴虚血瘀为临床常见证型。脑梗死临床治疗多以中西医结合治疗为主，其原则在于中西医相互补充，取二者之长，如西医改善脑循环的药物有限，而中药中大部分活血化瘀药物均具有改善脑循环的作用[4]。作为改善脑梗死后脑循环的药物，丁苯酞常与三七通舒联用，且有研究表明三七通舒胶囊联合丁苯酞可有效改善急性脑梗死患者神经损伤程度，降低血液黏度，防止血栓形成等[13]。

    本研究从GEO芯片数据出发，PPI网络和富集分析结果表明，2种证型特异基因均可通过多组分、多方式、多途径参与脑梗死的病理进程。但气虚血瘀证特异基因中MMP-9、EIF4A3等相互作用最为明显，富集通路主要为T细胞受体信号通路等;阴虚血瘀特异基因则聚集在EGFR、STAT3等，主要通路为ErbB信号通路等，提示证型不同，作用靶点及途径可能存在差异，为证型相关研究提供依据。

    进一步利用Pubchem、Swiss Target Prediction获取274个三七通舒胶囊联合丁苯酞的活性成分预测靶点，整合药物活性成分预测靶点与脑梗死血瘀证共性基因，获得32个三七通舒胶囊联合丁苯酞治疗脑梗死血瘀证的作用靶点。共同靶点PPI网络结果表明药物主要作用靶点为SRC、CASP3、NR3C1、PIK3CA、PIK3R1、PIK3CG等，GO富集及KEGG富集结果表明，三七通舒胶囊联合丁苯酞主要在多细胞组分通过调节多种激酶如蛋白激酶、氨肽酶、磷脂酰肌醇-3-激酶的活性、激酶结合、蛋白质结合等方式，参与血管内皮生长因子受体信号通路、蛋白质磷酸化、磷脂酰肌醇介导的信号传导等生物过程，通过趋化因子信号通路等发挥作用。相关拓扑分析筛选出核心靶点SRC，行分子对接表明三七通舒胶囊联合丁苯酞主要活性成分可与c-SRC活性位点以氢键、巯基疏水键、Pi/巯基疏水键、范德华力等方式结合并发挥调控作用。

    研究表明，在脑梗死早期，血脑屏障完整性的破坏不仅是梗死的结果，更会导致中风的进一步发展。在创伤和缺血性损伤的病理情况下，星形胶质细胞分泌炎症介质如血管内皮生长因子A（VEGFA）、基质金属蛋白酶（MMPs）、趋化因子和细胞因子等，这些因素直接或间接加剧了脑损伤和血脑屏障的破坏[14-16]。MMPs的激活是缺血性血脑屏障破坏的主要原因，而MMPs抑制剂通常被认为是血脑屏障的保护剂[17]。抑制MMPs的活性是中药如通窍活血汤等血脑屏障保护作用的关键[18]。SRC激酶家族是涉及多种细胞过程（包括血脑屏障调节）的信号蛋白，已有研究表明，SRC激酶可调节MMP，从而参与血脑屏障的调节[19]，而抑制SRC激酶的磷酸化可能诱发脑梗死血脑屏障损伤并减轻脑水肿和梗死[10]。此外脑梗死后SRC激酶可调节大脑中VEGF介导的血管通透性，抑制SRC活性可降低血管通透性，从而减轻脑损伤[11]。PI3K/AKT通路的激活可介导下游核因子κB途径减轻炎症反应以减少血脑屏障的破坏[20]。而PI3K/AKT通路可作为SRC的下游发挥作用[21]。

    而丁苯酞预处理可减轻MCAO模型的血脑屏障损伤和脑水肿[22-23]。其可通过上调紧密连接打败下调小窝蛋白减轻脑缺血再灌注损伤诱导的血管通透性惡化，从而改善神经功能和脑血流量，但其上游机制尚未得到明确阐述[24]。人参皂苷Rg1可能通过下调蛋白酶激活受体1（PAR-1）来减轻大鼠局灶性脑缺血所致的神经损伤、脑梗死体积和血脑屏障通透性[25]。冰片配伍黄芪甲苷与三七总皂苷能不同程度降低脑缺血/再灌注后血脑屏障（BBB）通透性的增加，减轻脑水肿，对抗脑组织损伤[26]。此外，三七皂苷R1可通过PI3K/AKT通路减轻脑缺血缺氧性损伤[27]。人参皂苷代谢产物可通过抑制c-SRC/EGFR的磷酸化，介导下游信号分子的失活[28]。

    综上所述，通过整合多个数据库，分析脑梗死气虚血瘀证、阴虚血瘀证证型相关特异基因，揭示了证型相关富集特点，为证型相关研究提供依据。“药物-疾病-证型”共同靶点的分析结果揭示了三七通舒胶囊联合丁苯酞治疗脑梗死血瘀证可能的通用机制。预测其可能通过调节SRC磷酸化，介导下游PI3K相关信号通路调节脑梗死血瘀证早期血脑屏障的通透性以减轻脑水肿，发挥早期脑梗死保护作用，为早期使用三七通舒胶囊联合丁苯酞治疗脑梗死提供依据。

    参考文献

    [1]GBD 2017 Causes of Death Collaborators.Global，regional，and national age-sex-specific mortality for 282 causes of death in 195 countries and territories，1980-2017：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J].Lancet，2018，392（10159）：1736-1788.

    [2]Zhou M，Wang H，Zeng X，et al.Mortality，morbidity，and risk factors in China and its provinces，1990-2017：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J].Lancet，2019，394（10204）：1145-1158.

    [3]中华医学会神经病学分会，中华医学会神经病学分会脑血管病学组.中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018[J].中华神经科杂志，2018，51（9）：666-682.

    [4]高长玉，吴成翰，赵建国，等.中国脑梗死中西医结合诊治指南（2017）[J].中国中西医结合杂志，2018，38（2）：136-144.

    [5]Szklarczyk D，Gable AL，Lyon D，et al.STRING v11：protein-protein association networks with increased coverage，supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D607-D613.

    [6]方丽波，刘广志.三七三醇皂苷生物学功能的研究进展[J].华西药学杂志，2009，24（5）：557-560.

    [7]Kim S，Chen J，Cheng T，et al.PubChem 2019 update：improved access to chemical data[J].Nucleic Acids Res，2019，47（D1）：D1102-D1109.

    [8]Burley SK，Berman HM，Christie C，et al.RCSB Protein Data Bank：Sustaining a living digital data resource that enables breakthroughs in scientific research and biomedical education[J].Protein Sci，2018，27（1）：316-330.

    [9]Roskoski R Jr.Src protein-tyrosine kinase structure，mechanism，and small molecule inhibitors[J].Pharmacol Res，2015，94：9-25.

    [10]Mao XW，Pan CS，Huang P，et al.Levo-tetrahydropalmatine attenuates mouse blood-brain barrier injury induced by focal cerebral ischemia and reperfusion：Involvement of Src kinase[J].Sci Rep，2015，5：11155.

    [11]Paul R，Zhang ZG，Eliceiri BP，et al.Src deficiency or blockade of Src activity in mice provides cerebral protection following stroke[J].Nat Med，2001，7（2）：222-227.

    [12]Bai Y，Xu G，Xu M，et al.Inhibition of Src phosphorylation reduces damage to the blood-brain barrier following transient focal cerebral ischemia in rats[J].Int J Mol Med，2014，34（6）：1473-1482.

    [13]尤一萍，何旻.三七通舒联合恩必普治疗急性脑梗死血液流变学及动力学的影响[J].中華中医药学刊，2020，38（2）：218-221.

    [14]Wiese S，Karus M，Faissner A.Astrocytes as a source for extracellular matrix molecules and cytokines[J].Front Pharmacol，2012，3：120.

    [15]Gelderblom M，Weymar A，Bernreuther C，et al.Neutralization of the IL-17 axis diminishes neutrophil invasion and protects from ischemic stroke[J].Blood，2012，120（18）：3793-3802.

    [16]Argaw AT，Asp L，Zhang J，et al.Astrocyte-derived VEGF-A drives blood-brain barrier disruption in CNS inflammatory disease[J].J Clin Invest，2012，122（7）：2454-2468.

    [17]Li Y，Zhong W，Jiang Z，et al.New progress in the approaches for blood-brain barrier protection in acute ischemic stroke[J].Brain Res Bull，2019，144：46-57.

    [18]Li L，Wang N，Jin Q，et al.Protection of Tong-Qiao-Huo-Xue Decoction against Cerebral Ischemic Injury through Reduction Blood-Brain Barrier Permeability[J].Chem Pharm Bull（Tokyo），2017，65（11）：1004-1010.

    [19]Guerrero J，Santibaez JF，González A，et al.EGF receptor transactivation by urokinase receptor stimulus through a mechanism involving Src and matrix metalloproteinases[J].Exp Cell Res，2004，292（1）：201-208.

    [20]Zhu Q，Enkhjargal B，Huang L，et al.Aggf1 attenuates neuroinflammation and BBB disruption via PI3K/Akt/NF-κB pathway after subarachnoid hemorrhage in rats[J].J Neuroinflammation，2018，15（1）：178.

    [21]Lin CC，Lee IT，Chi PL，et al.C-Src/Jak2/PDGFR/PKCδ-dependent MMP-9 induction is required for thrombin-stimulated rat brain astrocytes migration[J].Mol Neurobiol，2014，49（2）：658-672.

    [22]邱珂，邓淑文，刘慧，等.丁苯酞对SD大鼠脑出血后血脑屏障的影响及其机制[J].中南大学学报：医学版，2019，44（12）：1321-1329.

    [23]Yan RY，Wang SJ，Yao GT，et al.The protective effect and its mechanism of 3-n-butylphthalide pretreatment on cerebral ischemia reperfusion injury in rats[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21（22）：5275-5282.

    [24]Li J，Liu Y，Zhang X，et al.Dl-3-N-Butylphthalide Alleviates the Blood-Brain Barrier Permeability of Focal Cerebral Ischemia Reperfusion in Mice[J].Neuroscience，2019，413：99-107.

    [25]Xie CL，Li JH，Wang WW，et al.Neuroprotective effect of ginsenoside-Rg1 on cerebral ischemia/reperfusion injury in rats by downregulating protease-activated receptor-1 expression[J].Life Sci，2015，121：145-151.

    [26]丁煌，唐三，楊筱倩，等.冰片配伍黄芪甲苷与三七总皂苷对脑缺血/再灌注后血脑屏障通透性的影响[J].中国药理学通报，2019，35（11）：1516-1523.

    [27]Tu L，Wang Y，Chen D，et al.Protective Effects of Notoginsenoside R1 via Regulation of the PI3K-Akt-mTOR/JNK Pathway in Neonatal Cerebral Hypoxic-Ischemic Brain Injury[J].Neurochem Res，2018，43（6）：1210-1226.

    [28]Lee CS，Bae IH，Han J，et al.Compound K inhibits MMP-1 expression through suppression of c-Src-dependent ERK activation in TNF-α-stimulated dermal fibroblast[J].Exp Dermatol，2014，23（11）：819-824.

    （2020-07-15收稿 责任编辑：芮莉莉）