玛咖-人参水煎液对小鼠免疫功能的影响
陈红映 孙建辉 于泽玥
摘要 目的：探讨玛咖-人参水煎液对小鼠免疫功能的影响。方法：通过碳廓清试验、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验、绵羊红细胞诱导的小鼠迟发型变态反应试验、ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验（MTT法）、Jerne改良玻片法测定抗体生成细胞数试验、小鼠血清溶血素的测定，研究玛咖-人参水煎液对小鼠免疫功能的影响。结果：与空白组比较，玛咖-人参水煎液低、中、高剂量组均可明显提高小鼠吞噬指数（P<0.05或P<0.01），玛咖-人参水煎液低、中、高剂量组均可明显提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率（P<0.05或P<0.01）和吞噬指数（P<0.01），玛咖-人参水煎液中、高剂量组可明显提高小鼠足趾肿胀度（P<0.05），玛咖-人参水煎液高剂量组可明显提高小鼠溶血空斑数（P<0.01）。结论：玛咖-人参水煎液能提高小鼠单核-巨噬细胞功能、细胞免疫功能和体液免疫功能。
关键词 玛咖;人参;配伍;水煎液;免疫;单核-巨噬细胞;细胞免疫;体液免疫
Abstract Objective：To investigate the effects of Maka Renshend Decoction on immune function of mice.Methods：Antibody production was measured by carbon clearance test，mouse peritoneal macrophage phagocytic chicken red blood cell test，sheep red blood cell-induced delayed-type allergy test in mice，ConA-induced mouse lymphocyte transformation test （MTT method），and Jerne modified slide method Cell number test，determination of mouse serum hemolysin，and the effect of Maka Renshen Decoction on the immune function.Results：Compared with the blank control group， the low， middle and high dose Maka Renshen Decoction groups could significantly increase the phagocytic index of mice （P<0.05 or P<0.01）. The low， medium and high dose groups of Maka Renshen Decoction can significantly increase the phagocytosis rate of mouse macrophages and chicken red blood cells （P<0.05 or P<0.01） and phagocytic index （P<0.01）. The medium and high-dose groups of Maka Renshen Decoction can significantly increase the swelling of the toes of mice （P<0.05）， and the high-dose group of Maka Renshen Decoction can obviously increase the number of hemolytic plaques in mice （P<0.01）.Conclusion：Maka Renshen Decoction can improve the function of monocyte-macrophage，cellular immunity and humoral immunity in mice.
Keywords Lepidium meyenii Walp; Radix Ginseng; Compatibility; Decoction; Immunity; Monocyte-macrophage; Cellular immune; Humoral immunity
中图分类号：R285.5;R392.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.005
玛咖（Lepidium meyenii Walper，Maca），又称为“秘鲁人参”[1]，属于十字花科独行菜属一年生或两年生植物[2]，是南美洲安第斯山地区常用的药食两用植物之一。玛咖的营养成分和次生代谢产物较为丰富，具有提高免疫力、改善性功能、调节性激素、抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤、抗骨质疏松、降血糖及神经保护等功效[3-4]。近些年来，玛咖产品风靡全球市场，成为畅销的保健食品之一。我国有利用玛咖进行开发利用的食品，如玛咖饮品和玛咖酒，也有与其他药材配伍而成的保健品，如玛咖枸杞胶囊、玛咖黄芪西洋参片等[5-7]。研究表明，玛咖性平微温，味甘、辛，归肾、肝、脾经，具有补肾益精，强筋壮骨，疏肝解郁的功效[8]。药理研究表明，玛咖可增强小鼠体液免疫功能和单核-巨噬细胞功能[9]，增加免疫器官重量[10]，对大鼠机体免疫功能具有双向调节作用[11]，增加能量代谢[12]。人参味甘、微苦，性微温，入脾、肺、心、肾经，有大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生津养血，安神益智等功效[13]。贾执瑛等[14]研究表明，人参的有效成分（人參总皂苷、二醇皂苷、三醇皂苷和人参多糖）对增强免疫力有不同程度的功效，其中人参二醇皂苷和人参多糖增强免疫力作用较为明显。
“正气存内，邪不可干。”提高人体免疫力，可增强机体的抗病能力，提高人体正气多以补脾健胃、补肾为主[15]。玛咖和人参分别在2011、2012年被批准为我国的新资源食品[16-17]。二者配伍，可协同增效，补肾益精、补脾益肺，本研究从细胞免疫、体液免疫和单核-巨噬细胞功能角度探讨玛咖、人参配伍后对机体免疫功能的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 KM种小鼠，SPF级，雌性，体质量16～20 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物许可证号SYXK（京）2017-0038，饲养于屏障环境。
1.1.2 药物 玛咖12 g、人参3 g，药材粉碎成粗粉，加8倍量水，煎煮2次，1 h/次，过滤，滤液合并，浓缩，得棕色液体，冷藏保存。
1.1.3 试剂与仪器 1）试剂：印度墨汁（国药集团化学试剂有限公司，批号：180320）;Na2CO3，（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20180323）;姬姆氏色素（生物染色剂，国药集团化学试剂有限公司，批号：20151214）;甲醇（分析纯，北京化工厂，批号：20171031）;Hb稀释液（南京建成生物工程研究所，批号：20180905）;刀豆蛋白A（ConA，Sigma公司，美国，批号：006K8411）;RPMI1640（Gibco公司，美国，批号：1830908）;MTT（Amresco公司，美国，批号：2174c194）;异丙醇（分析纯，北京化工厂，批号：20180524）。2）仪器：紫外可见分光光度计[岛津企业管理（中国）有限公司，型号：UV2600];电子天平（常熟市双杰测试仪器厂，型号：T1000）;电子天平（赛多利斯，型号：BS223S）;Thermo CO2培养箱（美国热电公司，美国，型号：371型）;LEICA生物显微镜（上海莱卡显微系统有限公司，型号：13395H2X）;游标卡尺（桂林山牌Ⅲ型游标卡尺，型号：游标卡尺）;离心机（上海安亭科学仪器厂，型号：TDL-5-A）;电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司，型号：SHH.W21.600C）;酶标仪（美国伯腾仪器有限公司，美国，型号：Elx808）。
1.2 方法
1.2.1 给药方法 人体推荐日用量为15 g，小鼠实验分别设人体推荐量的5倍、10倍、30倍，小鼠给药剂量1.25、2.50、7.50 g/kg体质量，设为低、中、高剂量。
1.2.2 小鼠碳廓清实验
选取KM种雌性小鼠48只，按体质量随机分为空白对照组和玛咖-人参水煎液高、中、低剂量组，每组12只。各受试组给予相应剂量玛咖-人参水煎液，空白对照组给予等体积蒸馏水（10 mL/kg）灌胃，1次/d，连续42 d。指标检测：按照体质量从小鼠尾静脉注射稀释后的印度墨汁（0.05 mL/10 g体质量）。注入墨汁后的2 min、10 min，分别从小鼠内眦静脉丛取血20 μL，并将血液置于2.0 mL 0.1% Na2CO3溶液中。用UV2600紫外分光光度计在600 nm波长处测光密度值（OD），以0.1% Na2CO3溶液作为空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏称重。按公式计算吞噬指数（α），表示小鼠碳廓清的能力。式中OD1、OD2分别为2 min、10 min时采血所得血液的光密度值，t1、t2为注射印度墨汁后的取血时间。K=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1）;a=体质量/（肝重+脾重）×K1/3。
1.2.3 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（半体内法）
分组、给药同“1.2.2”项。指标检测：小鼠经腹腔注射20%鸡红细胞悬液1 mL，30 min后，处死小鼠，腹腔注射生理盐水2 mL，按揉小鼠腹部20次。取小鼠腹腔巨噬细胞洗液1 mL，分别滴在2片载玻片上，置37 ℃温育30 min。生理盐水漂洗，晾干，用1∶1丙酮甲醇溶液固定，以吉姆沙-磷酸缓冲液染色，并用蒸馏水漂洗，晾干。在油镜条件下计数，每片计数100个巨噬细胞，按以下公式计算吞噬率和吞噬指数，得出的吞噬百分率按以下公式进行数据转换，X=sin-1P，P代表吞噬百分率，用小数表示。吞噬百分率（%）=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100%;吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数。
1.2.4 迟发型变态反应（DTH）实验（足跖增厚法） ?分组、给药同“1.2.2”项。指标检测：取羊血，生理盐水洗涤3次，小鼠腹腔注射0.2 mL 2% SRBC悬液，致敏后4 d，测量小鼠左后足跖部的厚度。在测量部位经皮下注射20 μL 20% SRBC悬液，在注射后24 h测量小鼠的左后足跖部厚度。以上2次测量均在同一部位，且测量3次，取其平均值。以前后足跖厚度的差值来表示迟发型变态反应的程度。
1.2.5 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验（MTT法）
分组、给药同“1.2.2”项。指标检测：在无菌条件下，取小鼠脾脏，置于盛有无菌Hank′s液的平皿中，制成单个细胞悬液。筛网过滤制成脾细胞悬液。Hank′s液洗并离心，重复2次。将脾细胞悬浮于1 mL的培养液中，镜检计数，然后将细胞浓度调整为3×106个/mL。将脾细胞悬液分两孔加入培养板中，每孔1.0 mL，一孔加入75 μL ConA液，另一孔作为对照，置CO2培养箱中培养72 h。培养结束4 h前，每孔吸去上清0.7 mL，并加入相同体积的RPMI1640培养液，同时加入MTT 50 μL/孔，继续培养4 h。每孔分别加入1 mL酸性异丙醇，溶解紫色结晶。然后用紫外分光光度计在570 nm波长处测定。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值差值來表示淋巴细胞的增殖能力。
1.2.6 抗体生成细胞数的测定（Jerne改良玻片法）
分组、给药同“1.2.2”项。指标检测：取羊血，用生理盐水洗3次，小鼠腹腔注射0.2 mL 2% SRBC悬液。将SRBC免疫5 d后的小鼠处死，取脾脏，将脾脏磨碎，制成细胞悬液。离心后，分别用Hank′s液洗2遍，将细胞悬浮在8.0 mL Hank′s液中。琼脂糖溶解后，与等量双倍Hank′s液混合，用小试管分装，每管加入0.5 mL，并向管内加入50 μL 10% SRBC悬液和8 μL脾细胞悬液，迅速混匀，倒于具有琼脂糖薄层的玻片上，待琼脂凝固后，放入CO2培养箱中温育1 h，在玻片架凹槽内加入用SA缓冲液稀释8倍的补体，继续温育1.5 h，然后计数溶血空斑数。用空斑数/全脾细胞来表示抗体生成细胞数。
1.2.7 半数溶血值（HC50）的测定
分组、给药同“1.2.2”项。指标检测：取羊血，用生理盐水洗3次，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%SRBC悬液。5 d后，摘眼球取血，放置约1 h，离心，收集血清。取1.0 mL稀释300倍的血清置试管内，分别加入0.5 mL 10%SRBC悬液，1.0 mL稀释8倍的补体。另设对照管，以SA缓冲液代替血清。37 ℃水浴15 min后，冰浴终止反应。10 min，取l.0 mL上清，加3.0 mL Hb稀释液。取0.25 mL 10%的SRBC悬液，加Hb稀释液至4.0 mL于另一试管中，混匀，放置10 min后，在540 mm波长处测定各管光密度值。以半数溶血值（HC50）表示溶血素的量，按以下公式计算：样品半数溶血值=样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数。
1.3 统计学方法
采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析。采用方差分析，先进行方差齐性检验，方差齐，再计算F值，若F值<F0.05，则各组均数间差异无统计学意义;F值≥F0.05，P≤0.05，采用多个观察组和一个对照组间均数的两两比较方法进行数据统计;对方差不齐或非正态的数据进行变量转换，若满足正态或方差齐要求，用经转换以后的数据统计;若变量转换后仍未达到正态或方差齐要求，改用秩和检验进行数据统计。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 玛咖-人参水煎液对小鼠吞噬指数的影响 与空白对照组比较，玛咖-人参水煎液各剂量组均可明显提高小鼠吞噬指数，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见表1。
2.2 玛咖-人参水煎液对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率和吞噬指数的影响
与空白对照组比较，玛咖-人参水煎液各剂量组均可明显提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率和吞噬指数，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见表2、3。
2.3 玛咖-人参水煎液对小鼠足跖肿胀度的影响
与空白对照组比较，玛咖-人参水煎液中、高剂量可明显提高小鼠足跖肿胀度，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。
2.4 玛咖-人参水煎液对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖的影响
与空白对照组比较，玛咖-人参水煎液各剂量组对小鼠淋巴细胞增殖的影响均无统计学意义（P>0.05）。见表5。
2.5 玛咖-人参水煎液对小鼠溶血空斑数的影响
与空白对照组比较，玛咖-人参水煎液高剂量组可明显提高小鼠溶血空斑数，差异有统计学意义（P<0.01）。见表6。
2.6 玛咖-人参水煎液对小鼠血清溶血素的影响
与空白对照组比较，玛咖-人参水煎液各剂量组对小鼠半数溶血值的影响均无统计学意义（P>0.05）。见表7。
3 讨论
免疫力低下，即中医所讲的“虚证”。中医通过扶正、祛邪治疗“虚证”。扶正，是指调动机体抗病能力，增强免疫功能，从而提高机体的稳定性。祛邪，是指调节机体免疫平衡和抑制免疫反应，以增强机体的抗病能力[18]。正气通过识别“自己”和“非己”成分，清除病原微生物、突变细胞、衰老细胞等，以保障机体内环境的稳定[19]。在现代医学中，机体免疫分为特异性免疫和非特异性免疫。特异性免疫又分为细胞免疫和体液免疫。绵羊红细胞诱导小鼠迟发型变态反应试验、ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验可用于评价细胞免疫功能，抗体生成细胞检测、血清溶血素试验可用于评价体液免疫功能。小鼠碳廓清实验和小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验可用于评价单核-巨噬细胞功能（非特异性免疫）[20]。
本实验研究表明，经口给予小鼠玛咖-人参水煎液42 d后，与空白对照组比较，玛咖-人参水煎液低、中、高剂量均可明显提高小鼠的碳廓清能力（P<0.05或P<0.01），玛咖-人参水煎液低、中、高剂量均可明顯提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率和吞噬指数（P<0.05或P<0.01）;玛咖-人参水煎液中、高剂量均可明显提高小鼠足跖肿胀度（P<0.05）;玛咖-人参水煎液高剂量可明显提高小鼠抗体生成细胞数（P<0.01）。以上结果表明，玛咖-人参水煎液能提高小鼠单核-巨噬细胞功能、细胞免疫功能和体液免疫功能，为玛咖和人参配伍使用提供了实验依据。
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（2021-03-05收稿 责任编辑：徐颖）
