泽泻汤治疗梅尼埃病作用机制的网络药理学探讨

    陈与丰 陈建新 王雅蕾

    

    

    

    摘要 目的：通过网络药理学方法探讨泽泻汤治疗梅尼埃病（Meniere Disease，MD）的作用机制。方法：利用SymMap、TCMSP、TCMID、BATMAN-TCM等中医药数据库及TargetNet药物-靶点谱在线计算平台，获取泽泻汤有效成分及作用靶点;通过OMIM、Gene Cards、TTD、CTD等疾病基因数据库，获取MD相关靶标基因;利用STRING蛋白质数据库，构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络;利用Cytoscape信息分析软件，获取关键靶标基因、构建中药-有效成分-靶标基因网络图;利用R软件进行信号通路分析。结果：泽泻汤中69种有效成分可作用于88个MD相关基因，以核受体（如糖皮质激素受体）为主要作用靶点，参与IL-17、肿瘤坏死因子（TNF）相关的核因子κB信号通路介导的炎症反应。结论：由核受体糖皮质激素受体-核因子κB介导的炎症反应通路，可能是泽泻汤减少MD炎症反应，缓解膜迷路水肿的重要作用途径之一。

    关键词 梅尼埃病;糖皮质激素受体;泽泻汤;网络药理学;炎症反应

    Abstract Objective：To explore the mechanism of Zexie Decoction in the treatment of Meniere disease（MD） based on network pharmacology.Methods：SymMap，TCMSP，TCMID，BATMAN-TCM and other Chinese medicine databases and TargetNet drug-target spectrum online computing platform were used to obtain the effective ingredients and targets of Zexie Decoction; through OMIM，Gene Cards，TTD，CTD and other disease gene databases，MD-related target genes were obtained; STRING protein database were used to construct a protein interaction network; Cytoscape information analysis software was used to obtain key target genes，a network diagram of traditional Chinese medicine-active ingredients-target genes was constructed; R software was used to analyze signal pathways.Results：A total of 69 active components were screened from Zexie Decoction.These components acted on 88 related targets of MD.It took nuclear receptors （such as glucocorticoid receptors） as the main targets，and participated in the inflammatory response mediated by IL-17 and TNF-related NFκB signaling pathways.Conclusion：The inflammatory response pathway mediated by the nuclear receptor glucocorticoid receptor-NFκB may be one of the important pathways for Zexie Decoction to reduce MD inflammatory response and relieve membrane labyrinth edema.

    Keywords Meniere Disease; Glucocorticoid receptor; Zexie Decoction; Network pharmacology; Inflammation

    中圖分类号：R289.5;R276文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.07.008

    梅尼埃病（Meniere Disease，MD）是一种病因复杂、发病机制尚不明确的内耳疾病，以自发性的发作性眩晕、感音神经性耳聋（Sensorineural Hearing Loss，SNHL）、耳鸣和耳胀闷感为主要临床表现，膜迷路积水为主要病理学特征[1]。流行病学研究显示，MD在全球范围内均有发生，10万人中有3.5～513人患病，近10年来发病率呈上升趋势[2-3]。MD高发年龄为40～60岁，且患病率随年龄增长而增加，发病时常表现为单侧耳症状，并可持续数十年，每年发作6～11次[3]。近50%的MD患者合并抑郁症，78%～89%的MD患者正常工作、生活受到限制，严重影响生命质量[4-6]。尽管MD发病机制尚不明确，但研究普遍认为，膜迷路积水是其主要病理机制之一。氧化应激和炎症反应是膜迷路积水发生的核心[7];自由基过量产生和氧化应激引起的微血管损伤参与膜迷路积水的发展[8]。

    目前，美国耳鼻喉头颈外科学会（American Academy of Otolaryngology-Head and Neck Surgery Foundation，AAO-HNSF）指出，MD治疗的目标是预防或降低眩晕发作的严重程度和频率，缓解或预防听力损失、耳鸣和耳胀满感，改善整体生命质量[10]。西医多以利尿、改善微循环、免疫调节等原则，依据病程选择药物或手术改善临床症状，以眩晕发作次数减少为疗效指标，然而，对于长期发作造成的听力损害难以恢复[10]。戴春富和李轩毅[11]研究显示，鼓室内庆大霉素注射可有效控制90%的眩晕，通过鼓室内给药后，仅5%～10%的MD患者眩晕控制不佳，需要手术治疗。中医在MD治疗中也具有明显优势。2018年中华中医药学会提出，MD是中医治疗的优势病种，以泽泻汤为代表的中药配伍，可以有效改善MD患者眩晕、耳鸣等症状[12]。临床研究发现，加味泽泻汤联合敏使朗治疗多种证型MD，可明显缓解眩晕、耳鸣及耳闷症状，疗效优于单用敏使朗[13-14]。循证医学研究显示，泽泻汤在治疗MD方面有频次众多的大样本临床对照试验支持，且其中的中高级质量证据较多，属于治疗MD的优势高频方[15]。

    然而，泽泻汤治疗MD的作用靶点以及分子机制尚不明确。为探讨这一问题，我们采用网络药理学融合传统药理学和计算机技术，研究“药物-靶点-疾病”复杂关系，在大数据背景下展开中药复方多靶点、多通路作用机制的探讨，为泽泻汤治疗MD有效成分筛选、作用靶点及分子途径等，提供数据支持。

    1 资料与方法

    1.1 MD相关靶点的获得

    基于OMIM（https：//omim.org/search/advanced/geneMap）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）、CTD（http：//ctdbase.org/）、Gene Cards（https：//www.genecards.org/）等疾病基因数据库，以“Meniere Disease”（MeSH ID D008575）为检索词，搜索关于MD的相关靶点。整合各数据库结合Uniprot（https：//www.uniprot.org/），校正得到MD相关靶蛋白点。

    1.2 泽泻汤有效成分和靶点的获得

    通过SymMap（https：//www.symmap.org/）、TCMSP（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid/）等中医药数据库，查询泽泻、白术的所有化学成分。在中医药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库中设定口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为筛选条件，在SymMap数据库中设定DL≥30%为筛选条件获得有效成分。利用BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/index.php）、SymMap获取泽泻、白术有效成分对应的靶点基因，利用TargetNet（http：//targetnet.scbdd.com/）对靶点基因进行补充。BATMAN-TCM靶点筛选条件为Score off≥48，P-value为0.5，TargetNet靶点筛选条件为曲线下面积（AUC≥0.7），可能性（Probability>0.9）。通过Uniprot校正得到泽泻、白术有效成分及相关靶点基因。

    1.3 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与关键靶点基因筛选

    通过Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）将MD相关基因与泽泻、白术靶点基因映射筛选出共同基因，作为泽泻汤治疗MD的潜在作用靶点。通过STRING 11.0（https：//string-db.org/cgi/input.pl）构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）网络。基因来源为人类（Homo sapiens），最低交互分数（Minimum Required Interaction Score）要求为高置信度（High Confidence）（0.700）。接着通过Cytoscape3.8.0中CytoHubba插件，分别使用MCC、DMNC、MNC、Degree、EPC、BottleNeck、EcCentricity、Closeness、Radiality、Betweenness、Stress、ClusteringCoefficient共12种算法得到关键靶点基因，算法的不同可能导致某些重要靶点基因的遗漏或过度评价某些作用较小的靶点，因此对每种算法得出的评分在前20的关键靶点基因进行整合，得到在12种算法结果中至少出现2次的35个关键靶标基因。

    1.4 GO功能和KEGG通路分析

    利用R软件“BiocManager”及“org.Hs.eg.db”工具包，对潜在作用靶点进行ID转换，之后利用“clusterProfiler”工具包对其进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路分析，得到细胞组分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）、生物学过程（Biological Process，BP）和KEGG通路分析结果。利用R软件“clusterProfiler”工具包，对88个潜在作用靶点进行GO功能分析，包括它们的细胞组分（Cellular Component，CC），参与的分子功能（Molecular Function，MF）和生物学过程（Biological Process，BP）。进一步，利用R软件“clusterProfiler”工具包，对88个潜在作用靶点进行KEGG信号通路分析，探讨泽泻汤调节潜在作用靶点的作用途径。

    2 结果

    2.1 MD和澤泻汤相关靶点

    通过OMIM、Gene Cards、TTD、CTD等疾病基因数据库共得到MD相关靶点2 891个。通过TCMSP、SymMap、TCMID、BATMAN-TCM等中医药数据库检索泽泻汤中2味中药的化合物，结合OB和DL等指标筛选，得到潜在活性成分：泽泻27个，白术42个。将1.2预测的靶点去重后，共得到泽泻汤的活性成分作用靶点共222个。将泽泻汤活性成分作用靶点与MD疾病靶点相匹配，得到泽泻汤治疗MD的潜在作用靶点88个，将活性成分和潜在作用靶点导入Cytoscape 3.8.0软件进行网络构建，得到“药物-活性成分-潜在作用靶点”网络图（图1）。结果发现，白术中的白术内酯Ⅰ（Atractylenolide Ⅰ）、甘氨酸（Gly）、刺芒柄花素（Formononetin），泽泻中的泽泻二萜醇（Oriediterpenol）、谷甾醇（Sitosterol）与9个以上靶点相连接。

    为预测泽泻汤治疗MD的作用靶点，首先，在“药物-活性成分-潜在作用靶点”网络图中得出，4个靶点与药物成分关系密切，即与成分连接>10次的靶点，这些靶点依次是：前列腺素内过氧化物合酶2（Prostaglandin G/H Synthase 2 Precursor，PTGS2）连接29次，前列腺素内过氧化物合酶1（Prostaglandin G/H Synthase 1 Precursor，PTGS1）连接20次，核孕酮受体（Progesterone Receptor，PGR）连接12次，核受体亚家族3 C组成员1（Nuclear Receptor Subfamily 3 Group C Member 1，NR3C1）连接11次。

    为进一步验证上述预测结果，使用Venny 2.1.0，将泽泻、白术和MD的靶点相映射，并绘制韦恩图。见图2。与上述结果一致，筛选出包含PGR、NR3C1、PTGS1、PTGS2，以及BCL2、JUN、PON1、CYP17A1、CDC25B、ESR1、ACHE、ANXA1、NOS2、GRIN1、TRPA1、KCNH2、GRIA2在内的17个靶点。

    2.2 GO功能分析

    得到CC、MF、BP前20个结果，泽泻汤作用于MD的基因主要在膜筏、膜微区、膜区等细胞膜区域表达（图3）;这些靶基因主要参与配体门控离子通道的分子功能（图4），与类固醇代谢生物学过程密切相关（图5）。

    2.3 KEGG信号通路分析

    发现IL-17信号通路、Th17细胞分化、TNF信号通路等炎症反应相关通路为泽泻汤治疗梅尼埃病的主要作用通路。见图6。

    3 讨论

    3.1 泽泻汤治疗梅尼埃病的中医理论依据

    中医认为MD属于“耳眩晕”，是一种由耳病所致的以头晕目眩、天旋地转为主要特征的疾病[16]。早在《黄帝内经》时期就有关于眩晕与耳病相关的记载：“厥阴之胜，耳鸣头眩，愦愦欲吐，胃鬲如寒。”泽泻汤出自《金匮要略》，由泽泻、白术两味药物组成，具有健脾化饮、降逆止眩之效，系治疗痰饮所致眩晕之经方[17]。方中泽泻甘、淡，寒，有利水渗湿，行痰饮之功;白术甘、苦、温，归脾、胃经，可补气健脾以制水，杜生痰之源[18]。二者合用使水湿从小便而出，水饮下渗，浊阴得降，清阳可升，利水渗湿而不伤阴，从而共制痰饮上犯清窍，使眩晕得止[19]。

    3.2 泽泻汤治疗梅尼埃病的成分分析

    本研究发现，白术中的白术内酯Ⅰ（Atractylenolide Ⅰ）、甘氨酸（Gly）、刺芒柄花素（Formononetin），泽泻中的泽泻二萜醇（Oriediterpenol）、谷甾醇（Sitosterol）这5个成分可能是泽泻汤治疗MD的主要活性成分。邱美榕等[20]实验也表明，泽泻汤中白术多糖+泽泻多糖组分群可能是抗膜迷路积水的有效组分群;泽泻汤泻醇B、白术内酯的超临界萃取物可通过直接抑制内耳血管纹、螺旋韧带的水通道蛋白AQP2表达，通过AVP-V2R-cAMP途径，减轻耳蜗积水，治疗MD[21]。临床上，除膜迷路积水病理现象外，越来越多研究发现，MD患者伴有内耳局部甚至全身的炎症反应。Gazquez等[22]通过对690例MD患者的调查发现这些患者合并自身免疫性疾病的比例显著高于普通人群，B淋巴细胞数量的增加与耳聋和眩晕的持续正相关;Kim等[23]收集MD患者内耳淋巴液，发现分子量在23～48 kDa和63～75 kDa间的抗原抗体复合物，尤其是γ干扰素比正常对照组高10倍。回顾炎症反应的反应类型，以炎症反应蛋白产物如γ干扰素为特征的炎症反应属于急性期炎症反应的一种;慢性炎症反应主要以单核细胞增高为主要特征。这些临床发现表明，MD无论是急性发作期还是恢复期，都具有炎症反应的典型特征。

    3.3 泽泻汤治疗梅尼埃病的关键靶点分析

    基于网络药理学分析，我们发现PTGS1和PTGS2二者在治疗MD中居于重要地位。其中，PTGS1和PTGS2属于前列腺素内过氧化物合酶（PTGS），是前列腺素（PG）生物合成中的关键酶，PG是一种炎症介质，介导炎症反应发生，抑制表达PTGS能减少炎症反应发生[24]。PGR是核孕酮受体，可被类固醇激素影响从而减轻炎症反应发生[25]。NR3C1编码糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor，GR），参与炎症反应[26]。PGR、GR均属于核受体家族。在MD治疗中，泽泻和白术具有协同作用，可能通过核受体发挥抗炎作用。基于此，我们预测GR是泽泻汤的重要作用靶点之一。泽泻活性成分如谷甾醇（Sitosterol）、泽泻醇B醋酸酯（Alisol B monoacetate）、11-去氧泽泻醇-a（11-deoxyalisol a）、泽泻醇a（Alisol a）、泽泻醇E-23-醋酸酯（Alisol e 23-acetate），白术活性成分如白术内酯Ⅰ（Atractylenolide Ⅰ）、双白术内酯（Biatractylolide）、苍术酮（Hinesol）等均可作用于GR。分子对接技术还发现，泽泻醇M-23-乙酸酯和泽泻醇A-23-醋酸酯可作为拮抗剂，作用于GR，发挥抗炎作用[27]

    。动物实验中，泽泻总三萜可有效抑制IL-6分泌，减轻小鼠耳郭肿胀及大鼠棉球肉芽肿胀程度[28];陈琴华等[29]指出白术内酯Ⅰ、Ⅲ还能够促进炎性巨噬细胞细胞因子表达，参与抗炎反应。细胞实验中，白术内酯Ⅰ可以通过抑制核因子κB、ERK1/2和p38信号通路，抑制LPS处理的RAW264.7细胞炎症反应[30]。核因子κB炎症反应通路是糖皮质激素（Glucocorticoid，GC）與GR结合后抗炎的重要途径之一;炎症反应条件下，核因子κB成员p50/p65异二聚体是转录激活过程中最重要的形式，与相应DNA结合元件结合，转录激活TNF-α，IL-1，IL-2，IL-6，IL-8等下游因子，促进炎症介质、黏附分子等分泌和表达[31-32]。此外，1996年，Rarey和Curtis[33]首次在人类内耳中发现了糖皮质激素受体。内耳毛细胞内大量分布着GR[34]。临床观察发现，糖皮质激素（Glucocorticoids，GC），如地塞米松（Dexamethasone，DEX），可以有效控制MD患者的眩晕，用药6个月，可以缓解92%患者的临床症状[35];鼓室内注射GC治疗MD效果显著，可有效改善眩晕及听力[36]。GC通过与内耳GR结合，参与耳蜗内淋巴稳态调节[37-39]。然而，也有研究发现，长期使用DEX，不但有效率下降，还可增加不良反应风险[40]。因此，以GR为靶点，参与抗炎反应，是缓解MD局部或全身炎症反应的有效途径之一;找到具有糖皮质激素样抗炎作用，又不引起不良反应的药物，是提高MD临床疗效的关键。

    3.4 GO和KEGG結果分析

    GO功能分析结果与2.1靶点预测结果相一致。一方面表明泽泻汤可能直接作用于细胞膜上的靶蛋白，另一方面显示其与炎症反应相关的核受体、细胞因子等作用通路密切相关。进一步，基于KEGG信号通路分析，发现IL-17、Th17和TNF等炎症反应信号参与泽泻汤治疗MD中，与上述功能分析一致。结合文献研究发现，与炎症反应相关的核因子κB通路为上述三条炎症反应相关通路的下游通路，核因子κB通路可能是泽泻汤抗炎的主要途径之一。IL-17家族是由IL-17A-F组成的细胞因子的一个子集，在急性和慢性炎症反应中都起着至关重要的作用。IL-17A是T辅助细胞17（Th17）亚群的标志物，保护宿主免受细胞外病原体的侵害，在自身免疫性疾病中参与炎症反应[41];Th细胞的平衡分化对机体的免疫和宿主保护至关重要[42]。IL-17家族通过与相应受体结合，激活包括核因子κB，MAPK和C/EBP等在内的下游途径，导抗菌肽、细胞因子和趋化因子的表达，参与炎症反应[43]。临床研究发现，富集在IL-17信号通路上的IL-1β、MMP-9、TNF和MAPK等基因，与内耳疾病密切相关。在于中耳炎中耳积液和细菌性脑膜炎患者的脑脊液，炎症介质IL-1β大量释放[44];在慢性中耳炎、内耳积水中，MMP-9的表达水平与病程正相关[45]。TNF是一种重要的细胞因子，可诱导多种细胞内信号途径，包括细胞凋亡、细胞成活、炎症反应和免疫等。活化的TNF组装成一个高三聚体，与受体（TNFR 1，TNFR 2）结合，诱导多种基因激活，该通路主要受核因子κB通路和MAPK级联反应控制[46-47]。TNF-α会诱导豚鼠感觉神经性听力损失和突触退化[48]。在IL-1β诱导内耳损伤模型中，DEX可以通过抑制IL-1β介导的MMP-9途径，保护内耳免受损伤[49]。研究表明，参与炎症反应的IL-17通路、TNF通路，均与核因子κB信号通路存在交互作用。

    因此，我们提出假说：泽泻汤有效成分与靶蛋白GR结合，抑制下游核因子κB通路，参与抗炎反应，是泽泻汤治疗MD的重要分子通路之一。然而，泽泻汤激活GR途径抗炎的同时，是否激活下游与不良反应相关的作用途径;GR-核因子κB通路如何参与膜迷路积水调节，目前还尚未见报道，有待进一步探讨。

    内耳由半规管、前庭、耳蜗3部分组成。毛细胞是内耳上的特殊感受器，是感受声波刺激的感觉上皮细胞。内耳毛细胞上GR表达丰富。泽泻汤活性成分Sitosterol、Alisol B monoacetate、11-deoxyalisol a、Alisol a、Alisol e 23-acetate、Atractylenolide ⅠBiatractylolide、Hinesol等可作用于GR。泽泻汤有效成分与GR结合后，入核与核内靶基因上的特定DNA序列结合，抑制核因子κB炎症反应通路，即核因子κB成员p50/p65异二聚体，与DNA结合元件结合，抑制TNF-α，IL-6等下游因子分泌。IL17、TNF信号通路与核因子κB信息通路交互作用。

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    （2020-12-01收稿 责任编辑：杨觉雄）