核酸适配体亲和柱净化-高效液相色谱法测定莲子中黄曲霉毒素B1

    赵颖 王楠 高华龙 郭子轩 陆安祥 郭晓军 卢静华 栾云霞

    

    

    

    摘?要?以特异性的核酸适配体作为识别元件，制备了黄曲霉毒素B1 （AFB1）的适配体亲和柱（AAC），用于AFB1 的特异性识别和富集。对AAC的载样液中有机溶剂含量、载样液的体积和淋洗体积等条件进行了优化。此AAC吸附AFB1 的柱容量达到（334.6±18.2） ng，且AAC可重复使用20次。莲子样品经AAC净化富集后，用高效液相色谱-光化学衍生荧光法检测，外标法定量，AFB1 检出限达到0.05 ng/mL，回收率为91.8%～108.6%。本方法为食品、农产品和中药等复杂基质中痕量毒素的提取富集和分析提供了新的参考，具有良好的应用前景。

    关键词?适配体亲和柱;黄曲霉毒素B1 ;固相萃取;N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化的琼脂糖;莲子

    1?引 言

    黄曲霉毒素B1 （Aflatoxin B1 ，AFB1）是由黄曲霉、寄生曲霉等真菌产生的次级产物[1]，毒性极强，被世界卫生组织的癌症研究机构划分为I类致癌物[2]。AFB1 具有致突变性、致畸性和致癌性[3～5]，可在采摘前、收获后储存、运输和食用等不同阶段对农产品、食品及中药材等产生污染[6]，威胁人类健康。很多国家对AFB1 都有严格的限量标准，欧盟规定中药材（植物药）中AFB1 的限量标准为2 μg/kg[1]，我国规定中药材中AFB1 的限量标准为5 μg/kg[8]。因此，为了及时发现污染，防止AFB1 进入食物链，并尽量减少国际交易中贸易壁垒带来的损失，研究人员不断寻求快速、可靠地定量检测黄曲霉毒素的方法。

    莲子是水生草本植物莲的种子，富含蛋白质、维生素和矿物质，可食药两用[7，8]。然而，莲子极易被黄曲霉毒素污染[9]，特别在中国南方莲子主产区，其湿润的气候条件适宜AFB1 的产生，对消费者的健康造成极大威胁。因此，有必要对莲子中AFB1 的污染状况进行监测和评价[10]，建立莲子中黄曲霉毒素的有效分析方法，而对莲子样品中AFB1 进行提取富集是提高其检测灵敏度的关键。

    目前，常用的AFB1 定性与定量检测方法有高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography，HPLC）[11～14]、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-tandem mass spectrometry，HPLC-MS）[15]、酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）[16，17]及薄层色谱法（Thin-layer chromatography，TLC）[18，19]等，广泛用于谷物、豆类、坚果、调味品、婴幼儿配方食品和辅助食品中AFB1 的测定[20～23]。免疫亲和柱（Immune affinity column，IAC）是检测AFB1 时广泛使用的前处理方法，已被我国国标、行业标准、中国药典、国际标准（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）等收录。然而，IAC以抗体为识别元件，而抗体生产依赖动物，存在批次差异大、成本高、对温度、pH值以及盐浓度依赖性强、不可逆变性等缺点[24，25]，导致IAC存在价格昂贵、难以重复使用和检测成本高等问题。适配体是一类亲和力高和特异性强的单链核苷酸分子，具有可选择性识别特定靶标的能力。作为“化学抗体”，核酸适配体具有良好的热稳定性和化学稳定性、易于修饰、可体外制备和合成成本低等天然优势[26]。因此，制备适配体亲和柱（Aptamer affinity column，AAC）用于真菌毒素的净化富集，具有良好的应用前景。

    目前，以适配体为识别元件的親和柱已被用于血液、啤酒和花生中小分子目标物的前处理，如可卡因、赭曲霉毒素A（Ochratoxin，OTA）等[27，28，23]。然而，用于富集净化中药材中AFB1 的AAC还未见报道。本研究以无毒的N-羟基硫代琥珀酰亚胺活化的琼脂糖（N-Hydroxy succinimide，NHS-sepharose）替代传统亲和柱中使用的高毒性溴化氰活化的琼脂糖作为固相载体[23，29，30]，制备了AFB1-AAC。对AFB1-AAC的柱容量、准确性、重复性和特异性等性能进行评价，并与AFB1-IAC的净化效果进行比较。将优化后的AAC用于莲子样品中AFB1 的净化富集，并利用高效液相色谱-光化学衍生荧光检测法（HPLC-PCD-FCD）进行分析检测。

    2?实验方法

    2.1?仪器与试剂

    1260系列高效液相色谱-荧光检测器（美国安捷伦公司）;0.2 μm针筒式滤膜过滤器（天津津腾实验设备有限公司）;玻璃纤维滤纸（110 mm，1.5 μm，青岛普瑞邦生物工程有限公司）;DHM200涡旋振荡器（宁波洛尚智能科技有限公司）;FE28 pH计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）;GmbH台式冷冻离心机（德国Sigma离心机有限公司）;光化学衍生器（北京华安麦科生物技术有限公司）;固相萃取柱管（1 mL带凸缘柱管，天津艾杰尔飞诺美公司）;黄曲霉毒素B1 免疫亲和柱（康源泰博生物科技有限公司）。

    5-氨基修饰的AFB1 适配体（5-GTT GGG CAC GTG TTG TCT CTC TGT TCG CCT TCG CTA GGC CCA CA-3）由上海生工生物技术有限公司合成。NHS活化的琼脂糖溶液（4B，90 mol/L）和Tris-HCl （Sigma-Aldrich公司）;AFB1 、黄曲霉毒素B2（Aflatoxin B2，AFB2）、黄曲霉毒素G1 （Aflatoxin G1 ，AFG1）、黄曲霉毒素G2（Aflatoxin G2，AFG2）标准溶液（美国Romer公司）;甲醇和乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司）。其它试剂均为国产分析纯试剂。实验用水为Milli-Q系统（美国Millipore公司）制备的超纯水。

    反应缓冲液（150 mmol/L NaCl，pH 6.0）;封闭缓冲液（150 mmol/L NaCl和0.2% BSA，pH 6.0）;清洗缓冲液（50 mmol/L Tris HCl和150 mmol/L NaCl，pH 6.0）;结合缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl、120 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2，pH 7.5），均于4℃保存。AFB1 标准品溶液（5 ng AFB1 标准品用结合缓冲液稀释并定容至30 mL）

    HPLC-PCD-FLD分析条件：色谱柱Venusil MP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦公司）;进样量40 μL;柱温箱为35℃;检测器为荧光检测器，激发波长360 nm，发射波长440 nm;为流动相为甲醇-水（55∶45，V/V），以0.8 mL/min流速进行等度洗脱[23]。

    2.2?亲和吸附剂的制备

    通过氨基与NHS共价偶联，将适配体固定在NHS活化的琼脂糖表面。首先，将氨基修饰的适配体溶于反应缓冲液，在95℃加热5 min，室温下静置30 min，使适配体形成所需的构象。取300 μL NHS活化的琼脂糖，用1 mL 10% HCl洗涤2次。将适配体加到NHS活化的琼脂糖孵育2 h，在室温下振荡。离心，去除上清液，加入封闭缓冲液，在室温下振荡2 h。将悬浮液装入1 mL 固相萃取柱管中，用5 mL清洗缓冲液清洗，最后用5 mL结合缓冲液将适配体亲和柱活化，于4℃保存。

    2.3?AFB1-AAC的操作流程

    将AFB1 标准品溶液加样至AAC，依次经过淋洗和洗脱，用HPLC检测洗脱液中AFB1 ，计算回收率，以筛选AAC的富集净化的最佳条件。首先，用5 mL结合缓冲液将AAC活化;然后，将30 mL AFB1 标准品溶液上样至AAC中，以1 mL结合缓冲液淋洗，1 mL甲醇洗脱。洗脱液于40℃氮吹至近干，用1 mL 液相色谱流动相复溶，过0.2 μm滤膜，用HPLC-PCD-FLD检测。

    AFB1-AAC的再生：使用前，AAC用5 mL结合缓冲液活化，经过富集净化过程后，用5 mL结合缓冲液活化，进行再生，4℃保存，以备下一次使用。

    2.4?样品处理

    准确称取5 g莲子样品（精确至0.01 g）和1 g NaCl，加入25 mL甲醇-水（70∶30，V/V）进行提取，使用涡旋振荡器，以2500 r/min振荡20 min后，10000 r/min离心10 min。每管中取5 mL上清液，稀释至50 mL，用玻璃纤维滤纸过滤，取续滤液，备用。以5 mL结合缓冲液活化AAC后，准确移取续滤液30 mL上样至AAC，1 mL结合缓冲液淋洗，将2～3 mL空气通过AAC，1 mL甲醇洗脱，收集的洗脱液在40℃氮吹至近干，用1 mL液相流动相复溶，过0.2 μm滤膜，转入进样瓶后，用HPLC-PCD-FLD检测。

    2.5?AFB1-AAC和AFB1-IAC的比较

    莲子加标样品（0.5、5和50 μg/kg）分别通过AFB1-AAC和AFB1 ?IAC进行净化和富集。根据AFB1-IAC的使用说明，取10 mL上清液，用20 mL水稀释后，用玻璃纤维滤纸过滤。将15 mL稀释液上样至IAC，10 mL结合缓冲液淋洗，通入2～3 mL空气，1 mL甲醇洗脱，洗脱液经40℃氮吹至近干，用1 mL液相流动相复溶，过0.2 μm膜。最后，分别用HPLC-PCD-FLD检测，计算回收率，比较IAC和AAC对AFB1 的识别与捕获能力。

    3?结果与讨论

    3.1?AFB1-AAC的富集原理

    将氨基修饰的AFB1 适配体共价偶联至NHS活化的琼脂糖上，制备AAC[31]。蓮子样品经过提取、过滤、稀释后，过柱。AFB1 与适配体特异性结合，未被结合的干扰物质被淋洗出来，flow of AFB1-apatmer affinity column （AAC）最后用甲醇洗脱，洗脱液用HPLC-PCD-FLD检测，AAC净化的步骤如图1所示，包括亲和柱的活化、样品的载入（载样过程）、干扰物的淋洗和靶标的洗脱。

    3.2?AFB1-AAC应用条件的优化

    载样中有机溶剂浓度影响适配体结合活性，而AFB1 通常是用有机溶剂从样品中提取的，如本研究采用甲醇-水（70∶30，V/V），高浓度的甲醇会破坏适配体的结构。因此，需考察载样过程中适配体亲和柱对甲醇的最大耐受度。5 ng AFB1用含有不同浓度的甲醇（1%、5%、10%、25%、40%、55%和70%（V/V））的结合缓冲液稀释到30 mL，分别全部载样到适配体亲和柱中，用结合缓冲液淋洗，1 mL甲醇洗脱。由图2可见，随着甲醇浓度增加，AFB1 的回收率逐渐下降。载样液中甲醇浓度小于10%时，回收率接近100%，这与本研究组之前的研究结果一致[12，23]，表明甲醇浓度应控制在10%以下。因此，本研究采用10倍稀释法稀释提取液，以降低有机试剂的浓度和基质效应。

    进一步考察AAC捕获AFB1 的最大载样体积。将AFB1 （5 ng）标准品溶液分别用结合缓冲液稀释至1、 2、 5、 10、 20、 30、 50和65 mL[12，23]。，将稀释后的溶液分别上样到AAC中，以相同的淋洗和洗脱步骤处理，结果如图3A所示，当载样体积大于30 mL时，回收率低于70%。因此，在实际样品分析中，选择载样体积为30 mL，为文献[23]报道的AAC载样体积的6倍。在本课题组之前的报道[12]中，磁珠需在液相体系中进行实验，为开放体系;而本研究采用的AAC是在固相体系中进行净化富集，属于封闭体系，因此，AAC更适合富集纯化毒性靶标。另外，本研究的偶联方式与文献[12，23]有所不同。链霉亲和素和生物素非共价偶联的方式，存在载样体积小、不可重复使用等缺点[12];溴化氢活化的琼脂糖和氨基修饰的适配体的偶联反应需过夜反应，所需实验时间较长[23];而本研究中适配体和固相载体的偶联时间仅需2 h。对于痕量AFB1 的检测，载样体积的增加使更多的AFB1 被适配体识别捕获，经AAC富集净化后的洗脱液中目标物含量更高，有利于提高HPLC-PCD-FLD的检测灵敏度。

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