特异性检测珍珠龙胆石斑鱼虹彩病毒病的核酸适配体的筛选与鉴定
余庆 刘明珠 肖贺贺 易弋 程昊 Putra Dedi-Fazriansyah 黎思巧 李鹏飞
摘?要?石斑鱼虹彩病毒是一种核质DNA病毒，不仅给海水养殖造成巨大的经济损失，而且严重威胁全球生物多样性。为了进一步阐明石斑鱼虹彩病毒侵染致病的分子机理，同时为石斑鱼虹彩病毒病的预防、诊断和治疗提供新的理论依据，本研究以珍珠龙胆石斑鱼虹彩病毒（SGIV-Gx）感染的宿主细胞为靶标，采用指数富集配体系统进化技术（SELEX）筛选获得4条核酸适配体（LYGV1、 LYGV2、 LYGV3、 LYGV4），并对核酸适配体的性质进行了系统的分析研究。各条核酸适配体识别SGIV-Gx病毒感染的宿主细胞具有高特异性和高亲和性，筛选的核酸适配体无毒副作用，而且核酸适配体LYGV3具有一定的抗病毒效果。对核酸适配体的靶标性质进行了分析，结果表明，核酸适配体（LYGV1、 LYGV2、 LYGV3、 LYGV4）的靶标可能是细胞膜蛋白或膜蛋白相关成分。其中，核酸适配体LYGV1的靶位点在SGIV-Gx病毒感染细胞2 h后出现在宿主细胞表面，核酸适配体LYGV2、LYGV3和LYGV4的靶位点的出现时间分别为病毒感染细胞后的4、8和6 h。
关键词?石斑鱼虹彩病毒;指数富集配体系统进化技术;核酸适配体;特异性;抗病毒;靶蛋白
1?引 言
石斑鱼肉质细腻，营养丰富，为大宗名贵海水养殖鱼类，目前国内养殖年产量已达15万吨以上，直接产值超过百亿元，经济价值极高[1，2]。然而，随着石斑鱼养殖密度增加、养殖规模扩大，养殖环境日益恶化，进而导致了鱼类疫病频繁暴发，经济损失巨大[3]。其中，石斑鱼虹彩病毒危害严重的石斑鱼疫病病原，其所导致的鱼病致死率极高[4]。目前，研究者已对石斑鱼虹彩病毒开展了系统研究，包括石斑鱼虹彩病毒的流行病学调查、病原分离鉴定、石斑鱼细胞系构建、病毒粒子的超微结构观察、检测诊断技术开发等，在一定程度上揭示了石斑鱼虹彩病毒的侵染致病机理[5～7]。在目前高密度、集约化的养殖环境下，石斑鱼虹彩病毒通常表现为暴发式感染，会在较短时间内导致人工养殖石斑鱼大批死亡，因此，必须着力研发能够快速、便捷检测石斑鱼虹彩病毒病的检测技术，实现对病毒的及时诊断，保障养殖业健康持续发展。Qin等[8]制备了虹彩病毒SGIV的高特异性抗体，研发出可以特异性检测石斑鱼虹彩病毒感染的流式检测技术。
核酸适配体是利用指数富集的配体系统进化技术（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）在体外经过多轮严格筛选得到的高特异性识别靶物质的单链寡核苷酸。核酸适配体结构稳定，对温度等外界环境的耐受性高，具有易于化学合成和化学修饰等诸多优点[9，10]，广泛应用于病原或疾病诊断治疗等生命科学领域[11～14]。基于核酸适配体能够识别病原微生物或病变细胞的高特异性高亲和性等特性，核酸适配体被用于生物传感器的构建，通过信号放大，实现对病原微生物或疾病的精确检测诊断。Duan等[15]利用高特异性识别食源性致病菌的核酸适配体，结合上转换荧光纳米标记技术和免标记传感器等构建了一系列灵敏、便捷的检测新方法，成功实现了对样品中目标致病菌的精确检测。Zhou等[16]利用特异性识别石斑鱼神经坏死病毒RGNNV衣壳蛋白CP的核酸适配体A10，开发了用于RGNNV精确快速检测的Sandwich ELASA方法，该方法灵敏度高、稳定性强，可用于养殖现场对病原的快速检测。此外，核酸适配体能够高特异性地结合在病原的特定部位，发挥功能阻断剂的作用，抑制病原的感染。Gao等[17]筛选了特异性结合Hepatitis C病毒NS2蛋白和包膜蛋白的ssDNA核酸适配体，对相关核酸适配体的抗病毒效果分析后发现，它们可有效抑制Hepatitis C病毒在细胞中的复制和装配。综上，核酸适配体在基础研究和应用研究中具有重要的理论意义、实际价值和应用前景。
本研究以珍珠龙胆石斑鱼虹彩病毒（SGIV-Gx）感染的石斑鱼脾细胞为靶标，采用SELEX技术筛选获得了可高特异性、高亲和性识别SGIV-Gx感染细胞的核酸适配体，并对核酸适配体的性质进行系统的研究，包括核酸适配体的特异性、亲和性、抗病毒活性、特异性主动，以及内吞能力和靶位点的性质等。
2?实验部分
2.1?仪器与试剂
Nikon C2激光共聚焦显微镜、TS2倒置光学显微镜（日本Nikon公司）;FACSAria II流式细胞仪（美国BD公司）;Multiskan Ascent多功能酶标仪、Nano Drop one超微量分光光度计;Mastercycler nexus gradient PCR仪（德国Eppendorf公司）;qTOWER3G touch荧光定量PCR仪（德国Analytikjena公司）;AC2-4S1生物安全柜（新加坡ESCO公司）;Centrifuge 5417R离心机（德国Eppendorf公司）;Gel Doc XR+凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）;DK-8D水浴锅（博讯公司）。
珍珠龙胆石斑鱼虹彩病毒广西株（Grouper iridovirus guangxi strain，SGIV-Gx）、中华鳖虹彩病毒（Soft shell turtle iridovirus，STIV）、石斑魚脾细胞（Grouper spleen cell，GS）和胖头鲤细胞（Fathead minnow cell，FHM）保存于本实验室[18，19];细胞培养瓶、细胞培养皿、波底皿、细胞6孔板和细胞12孔板（美国Corning公司）;胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS，美国GIBCO公司）;链霉亲和素标记的磁珠（美国Thermo公司）;PCR纯化回收试剂盒、胶回收试剂盒、DL2000 Marker、DL50 bp Marker（日本TakaRa公司）。磷酸盐缓冲溶液（PBS）： 2 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L Na2HPO4，137 mmol/L NaCl，pH 7.2。
2.2?实验方法
2.2.1?随机单链DNA文库和引物的设计构建?用于核酸适配体筛选的随机起始单链ssDNA文库、引物和核酸适配体均由上海生工公司合成。随机起始单链ssDNA文库由中间50 bp的随机核苷酸序列（N50）和两端的固定核苷酸序列构成（5-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-N50-CGAAGGACGCAGAGAAGTCTC-3）。5端引物序列为5-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3;3端引物序列为5-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3。其中，5端引物有两种，分别标记羟基荧光素（6-Carboxy-fluorescein labeled forward primer，FAM-FP）和无荧光标签的普通引物（FP）;3端引物标记生物素（Biotin labeled reverse primer，biotin-RP）。
2.2.2?SGIV-Gx病毒感染细胞（靶标细胞）的准备与处理?将石斑鱼脾细胞（GS）接入细胞培养瓶，瓶底基本铺满细胞后，细胞中接入20 μL SGIV-Gx（107 TCID50/mL）（TCID50（Tissue culture infective dose）是指病毒能使50%的组织培养细胞发生细胞病变（Cytopathic effect，CPE）的最小量），继续培养24 h后，移除细胞培养基，将细胞用PBS缓冲液轻轻洗涤2次，备用。
2.2.3?SELEX技术筛选流程?首轮筛选流程如下所述：将10 nmol随机起始单链DNA文库溶解在500 μL PBS缓冲液中，92℃高温变性8 min，迅速插入冰中，静置15 min。起始文库与靶标细胞在4℃孵育结合40 min后，离心，移除上清液，并且将靶标细胞用PBS缓冲液清洗。收集靶标细胞，在92℃孵育处理5 min，结合的单链DNA从靶细胞上解离，1000 r/min离心5 min，收集上清液中的单链DNA，将其作为模板进行PCR扩增。PCR程序为：94℃ 2 min，94℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃ 1 min，20轮循环;72℃ 5 min，获得双链dsDNA。
利用“链霉亲和素-生物素”结合系统分离得到单链核酸文库，用于次轮筛选。将100 μL包被有链霉亲和素的磁珠与PCR扩增所得的dsDNA室温孵育30 min，利用dsDNA中反向链上的生物素与磁珠上链霉亲和素的亲和作用，使dsDNA结合到磁珠上;磁性分离，将磁珠用PBS缓冲液清洗2次后，加入200 μL 200 mmol/L NaOH，室温孵育15 min，利用碱变性的方法将dsDNA的双链分离，正向核酸单链游离在上清液中，利用磁性分离器分离磁珠并收集上清液，用HCl溶液调节上清液pH值。将上清液中正向单链核酸用PCR纯化回收试剂盒纯化回收，收集单链核酸文库用于次轮筛选。为了提高后续筛选中核酸单链识别靶细胞的特异性和亲和力，在随后的筛选过程中逐步缩短核酸单链文库与靶标细胞的结合时间，同时减少核酸单链和靶标细胞的使用量，增加PBS缓冲液清洗靶标细胞的次数。
2.2.4?阴性筛选?为了提高筛选效率和成功率，在第3轮及第3轮以后筛选中，进行了阴性筛选，包括“阴性前筛选”和“阴性后筛选”。“阴性前筛选”是在每轮正式筛选前，即ssDNA单链文库与靶标细胞孵育结合前，先将ssDNA单链文库与正常GS细胞在4℃孵育1 h，离心，上清液即为经过“阴性前筛选”的单链核酸文库，将上清液与靶标细胞孵育结合。“阴性后筛选”是指每轮正式筛选后，收集靶标细胞上结合的ssDNA单链文库，然后将此文库与正常GS细胞在4℃孵育1 h，1000 r/min离心5 min，上清液即为经过“阴性后筛选”的单链核酸文库，以此文库作为模板进行PCR扩增。
2.2.5?核酸适配体序列的确定?将最终得到的单链核酸文库经PCR扩增为dsDNA，切胶回收后，连接到pUC-T 载体并转化到大肠杆菌DH5α中，菌液均匀涂布在LB 固体培养基（氨苄抗性），在28℃生化培养箱倒置培养过夜，挑取单克隆由上海生工公司测序，得到核酸适配体序列。使用MFOLD软件预测核酸适配体的二级结构。
2.2.6?激光共聚焦显微镜分析核酸适配体识别靶标细胞的特异性?将GS细胞接入玻底皿中，28℃培养18 h。将20 μL SGIV-Gx病毒（107 TCID50/mL）接入细胞中，对照组共两组，分别为不接入SGIV-Gx病毒的正常GS细胞和接入STIV病毒的FHM细胞。各组细胞在28℃继续培养24 h，在光镜下观察细胞的病变情况。FAM荧光标记的核酸适配体（500 nmol/L）经过92℃恒温水浴、冰浴处理后加入细胞中，4℃孵育40 min后，移除上清液，并用细胞培养基清洗，略干燥后，用抗荧光淬灭剂封片，使用激光共聚焦显微镜对各组细胞进行荧光观察。
2.2.7?流式细胞术定量分析核酸适配体识别靶标细胞的特异性?GS细胞接入24孔板中，28℃培养18 h。将20 μL SGIV-Gx病毒（107 TCID50/mL）接入24孔板的细胞中，28℃继续培养24 h。对照组共两组，分别为不接入SGIV-Gx病毒的正常GS细胞和接入STIV病毒的FHM细胞。在光镜下观察细胞的病变情况，然后收集24孔板中的細胞。FAM荧光标记的核酸适配体（500 nmol/L）经过92℃恒温水浴、冰浴的变复性处理，与病毒感染的细胞于4℃结合40 min。离心清洗3次，用500 μL PBS缓冲液重悬，使用流式细胞仪检测。每个反应均重复3次。
2.2.8?核酸适配体的细胞毒性分析?在96孔板中接种GS细胞，28℃培养18 h。将核酸适配体在细胞培养基中稀释至2000 和1000 nmol/L，与细胞于28℃孵育48 h。在各孔中加入20 μL CCK-8溶液，室温孵育4 h后，利用酶标仪检测450 nm的吸光值，以检测细胞活性，以未与核酸适配体孵育的正常GS细胞作为对照组，做3个平行实验。将测得的吸光值代入公式（1），计算各组细胞的存活率（Survival rate，SR）[20，21]：
2.2.9?核酸适配体的亲和常数计算?FAM荧光标记的核酸适配体经过92℃恒温水浴、冰浴的变复性处理后，稀释至不同浓度（0～2000 nmol/L），与SGIV-Gx病毒感染的GS细胞在4℃避光结合40 min。离心清洗3次，重悬在500 μL PBS中，用流式细胞仪检测，以FAM荧光标记的核酸适配体与正常细胞的结合作为对照。不同浓度核酸适配体与靶标细胞结合的荧光强度平均值减去相应对照细胞结合平均值，按公式（2）计算：
其中，Bmax表示核酸适配体与靶标细胞结合的最大平均荧光强度值。Y表示在核酸适配体在相应浓度下与靶标细胞结合的平均荧光强度值;X表示核酸适配体在相应浓度;Kd表示核酸适配体的亲和常数，采用Sigmaplot软件进行计算。每个反应均做3个重复。
2.2.10?核酸适配体的靶标性质分析?将SGIV-Gx病毒感染的GS细胞用胰酶消化处理2 min，将细胞离心清洗3次，与FAM荧光标记的核酸适配体（500 nmol/L）在4℃孵育40 min。离心清洗3次，然后重悬在500 μL PBS中，使用流式细胞仪检测。对照组中，FAM荧光标记的核酸适配体与SGIV-Gx病毒感染的GS细胞孵育结合。每个反应均做3个重复。
2.2.11?核酸适配体的靶标出现在SGIV-Gx病毒感染的GS细胞表面的时间?GS細胞在24孔板中28℃培养18 h，将20 μL SGIV-Gx（107 TCID50/mL）病毒接入24孔板的细胞中，28℃继续培养。分别在病毒感染的第2、4、6、8、10和12 h观察细胞的病变情况，收集细胞与FAM荧光标记的核酸适配体（500 nmol/L） 在4℃避光结合40 min。离心清洗3次，重悬在500 μL PBS中，用流式细胞仪检测。对照组将FAM荧光标记的核酸适配体（500 nmol/L）与正常GS细胞孵育结合。每个反应均做3个重复。
2.2.12?核酸适配体的抗病毒活性分析?核酸适配体对SGIV-Gx病毒的抑制效果分析实验参照文献[21，22]方法。GS细胞在24孔板于28℃培养18 h，然后将核酸适配体（500 nmol/L）与1 μL SGIV-Gx（107 TCID50/mL）病毒冰浴结合后接种入细胞。仅接入病毒、不接入核酸适配体的细胞作为对照组。然后分别在12和24 h收集24孔板中的细胞和培养基，提取RNA，反转录扩增获得cDNA，以cDNA为模板，β-actin基因作为内参基因，利用RT-qPCR技术检测石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP基因和病毒囊膜蛋白VP19基因的表达量，每个反应均做3个重复。结果用于分析核酸适配体的抑制SGIV-Gx病毒的抗病毒活性。RT-qPCR技术检测MCP基因和囊膜蛋白VP19基因所使用的引物见表1。
3?结果与讨论
3.1?SELEX技术筛选SGIV-Gx病毒感染细胞（靶标细胞）的特异性核酸适配体
细胞被病毒感染时，细胞膜成分将发生修饰或改变，这些修饰和改变是识别病毒感染细胞和病毒感染治疗的重要生物标志物[23]。本研究以SGIV-Gx病毒感染的石斑鱼脾细胞（GS）为靶标细胞，运用SELEX技术进行靶标细胞的核酸适配体筛选。以FAM荧光标记的随机ssDNA文库（500 nmol/L）与靶标细胞的结合为对照，利用流式细胞术检测发现，随着筛选轮数增加，单链核酸文库的特异性逐步升高，经过12轮筛选，第11轮的单链核酸文库对靶标细胞的特异性识别能力最强（图1）。因此对第11轮的筛选文库进行克隆测序，共得到4条核酸适配体LYGV1、LYGV2、LYGV3、LYGV4（表2）。已报道了一些针对病毒性或细菌性病的特异性核酸适配体[13，20～30]等。目前，核酸适配体的技术难点仍然主要在于筛选流程，不同物质作为靶标进行核酸适配体的筛选，所需的SELEX技术筛选轮数和参数不同，SELEX技术仍未能实现自动化和标准化，因此筛选出高特异性核酸适配体的难度较高。例如，Liang等[22]以狂犬病病毒感染细胞为靶标，经过35轮的筛选才最终得到高特异性的核酸适配体T14和 F34;而Zhou等[20]仅经过11轮的筛选就获得了特异性识别赤点神经坏死症病毒的核酸适配体。本研究为了提高筛选效率，参考文献报道，对阴性筛选流程进行了优化改进，分别设置了“阴性前筛选”和“阴性后筛选”，因此，经过11轮筛选就成功获得了高特异性识别SGIV-Gx病毒感染的石斑鱼脾细胞的核酸适配体库。
3.2?核酸适配体二级结构预测与分析
利用MFOLD对筛选获得的核酸适配体LYGV1、LYGV2、LYGV3、LYGV4的二级结构和吉布斯自由能（ΔG）进行预测分析。4条核酸适配体的二级结构预测结果表明，它们均会形成独特复杂的茎环结构，其中LYGV3的吉普斯自由能（ΔG）最低，为26.80 kJ/mol，提示其结构最稳定（图2）。在二级结构的基础上，核酸适配体通过氢键、碱基堆积和范德华力等自折叠形成更复杂的立体结构，当靶物质存在时，核酸适配体可以通过自适应变化、空间构型互补，特异性识别和结合到靶物质的结构位点。因此这些二级茎环结构构成了核酸适配体与靶物质特异性结合的结构基础[11，31]。据报道，核酸适配体的部分核苷酸序列或结构域对于其特异性是非必需的，在未来的研究中，有必要对核酸适配体的高特异性识别靶物质的核酸序列或结构域进行分析鉴定，这对于优化核酸适配体结构、制备具有更高亲和力和特异性的核酸适配体用于相关功能产品的开发具有重要意义[31]。
3.3?适配体的特异性分析
可用于核酸适配体筛选的靶标种类广泛，包括金属离子、无机和有机小分子、肽和蛋白质等单一靶标分子，以及病毒、寄生虫、细胞、组织等复杂生物靶标体系[32]。但是，针对细胞复杂靶标体系的筛选，最终获得的特异性核酸适配体库可能会更复杂，这不仅取决于复杂靶标体系中目标分子的数量和丰度，还取决于核酸适配体自身针对不同靶标分子的特异性。对本研究筛选获得的核酸适配体的特异性进行了系统分析（图3）。流式细胞术检测结果表明，实验组SGIV-Gx病毒感染的细胞荧光值高，对照组细胞的荧光值较低，而且实验组与对照组的数据差异极显著，说明核酸适配体LYGV1、LYGV2、LYGV3、LYGV4识别SGIV-Gx病毒感染的细胞具有高特异性（图3A）。
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