中药全蝎白术白头翁组合品发酵前后水提液不同截留分子量段的活性成分及体外抗肿瘤研究
刘金虎 赵国庆 毛会秀 方园 陶然 张瑞 史磊 王集会
摘 ?????要：比较全蝎白术白头翁组合发酵品（SAPZFP）与未发酵品（SAPZP）水提液不同截留分子量冻干粉活性成分及体外抗肿瘤活性的差异。分别测定各截留分子量段水溶性氨基酸、蛋白质、多糖的含量，并采用MTT法研究其对乳腺癌细胞株MCF - 7的抑制作用。SAPZFP截留分子量<5、5 ～ 10、>10 kDa冻干粉对乳腺癌细胞株MCF - 7的IC50分别为0.854、0.315、0.071 mg·mL-1;SAPZP的分别为1.128、0.360、0.115 mg·mL-1。SAPZFP截留分子量>10 kDa的抗腫瘤活性显著，球孢白僵菌双向固体发酵技术可显著增强本组合物的体外抗肿瘤活性。
关 ?键 ?词：中药组合品;超滤;水溶性活性成分;抗肿瘤
中图分类号：R285.5 ??????文献标识码：?A ??????文章编号： 1671-0460（2020）01-0032-05
Study on the Active Constituents?and Anti-tumor Activity in Vitro of Water Extracts?With Different Molecular Weight Cut-off Segments of Chinese Medicine Scorpio，?Atractylodes Macrocephala and Pulsatillachinensis
Mixture?Before and After Fermentation
LIU Jin-hu1，ZHAO Guo-qing1， MAO Hui-xiu1， FANG Yuan1， TAO Ran1， ZHANG Rui1， SHI Lei1， WANG Ji-hui2*
（1. College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Shandong?Jinan 250355， China;
2. Center of Experiment， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Shandong Jinan 250355， China）
Abstract： The active constituents and anti-tumor activity in vitro among different molecular weight range of lyophilized powders of SAPZFPs and SAPZPs water extract were compared. The contents of water-soluble amino acid， protein and polysaccharide in various molecular weight ranges?were determined and the inhibitory effect of the drugs on mammary cancer cells strain MCF - 7 was studied by MTT assay. The IC50?of SAPZFP with < 5， 5 ～ 10，> 10 kDa on mammary cancer cells strain MCF - 7 were 0.854， 0.315， 0.071 mg·mL-1， respectively. The IC50?of SAPZP were 1.128， 0.360， 0.115 mg·mL-1， respectively. The anti-tumor activity of SAPZFP with > 10 kDa was significant， and the bidirectional solid fermentation technology of Beauveria bassiana can markedly enhance the anti-tumor activity in vitro.
Key words： Chinese medicine composition; Ultrafiltration; Water-soluble active constituents; Anti-tumor
全蝎白术白头翁组合发酵品（SAPZFP），是将中药全蝎、白术、白头翁按一定配伍比例混合后作为培养基，通过球孢白僵菌（Beauveria bassiana（Bals.）Vuill）双向固体发酵技术制得的中药组合发酵品。文献报道，全蝎的抗肿瘤活性与可溶性蛋白质、多糖[1]、氨基酸[2]的含量有关，有报道白僵菌发酵可提高全蝎的多糖含量[3];白术多糖具有抗肿瘤及调节免疫的作用[4];白头翁糖蛋白具有免疫增强作用[5]。前期研究表明，在最佳水提工艺条件下，SAPZFP具有体外抗乳腺癌细胞株MCF - 7的活性。据此，本实验借助超滤膜分离技术，将SAPZFP、SAPZP的水提液分别制备成不同截留分子量段的冻干粉，并对其进行水溶性活性成分含量分析及体外抗肿瘤研究，以确定经球孢白僵菌发酵后是否影响本中药组合品不同截留分子量段的活性成分含量并增强其体外抗肿瘤活性，进而为后续有效成分的分离纯化及发酵技术机制的探究提供理论依据。
1 ?实验部分
1.1 ?仪器
生物安全柜（苏净集团苏州安泰空气技术有限
公司）;HPS - 5型卷式超滤组件、HPS - 10型卷式超滤组件、MSM - 1812型实验室用膜分离设备（上海摩速科学器材有限公司）;UV9100B型紫外可见分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司）;CKX41型奥林巴斯显微镜（Made in Philippines）;DNM - 9602型酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司）等。1.2 ?试剂
牛血清蛋白（上海伯奥生物科技有限公司）;RPMI Medium Modified培养基（HyClone）;PBS（1×）PH7.2（SparkJade）;胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）;MTT（BioFROXX赛国生物科技）;胰酶细胞消化液（biosharp）;福林酚（上海源叶生物科技有限公司）;其它试剂均为国产分析纯。
1.3 ?药材与细胞株
全蝎均为野生成年活蝎，购自山东临沂，经山东中医药大学高德民副教授鉴定为钳蝎科动物东亚钳蝎（Buthus martensii?Karsch）;白术、白头翁均购自河北安国中药材市场，经山东中医药大学高德民副教授鉴定符合2015版中国药典要求;乳腺癌细胞株MCF - 7由山东省立医院馈赠;球孢白僵菌桃5活化菌种（Beauveria bassiana（Bals.）Vuill）由山东省农业科学院植物保护研究所馈赠。
2 ?实验方法
2.1 ?SAPZFP的制备
2.1.1 ?全蝎冻干粉的制备
采用冻干非盐蝎制法[6]，取野生成年活蝎，除去杂质，洗净，于–?80℃冻结，打碎成浆，冷冻干燥即得，并低温密封保存。
2.1.2 ?PDA培养基的制备
根据张莉等[7]方法，称定200 g洗净去皮的马铃薯，切成小块，加水煮烂至能被玻璃棒戳破，用八层纱布过滤，加入20.00 g琼脂，继续加热，搅拌混匀，待琼脂溶解完全后，加入20.00 g葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后补水至1000 mL，分装至大试管中，于115℃灭菌25 min，制成斜面培养基。
2.1.3 ?球孢白僵菌孢子悬液的制备
将球孢白僵菌桃5活化菌种（Beauveria bassiana（Bals.）Vuill）用接种针无菌转接至PDA培养基，于25 ℃培养7?d后，将二代菌种用无菌水稀释至1×108个孢子·mL-1，得球孢白僵菌孢子懸液。
2.1.4 ?SAPZFP的制备
精密称定“2.1.1”项中经钴 - 60灭菌过的全蝎
冻干粉、白术粗粉、白头翁粗粉各10.00 g，加入“2.1.3”项中球孢白僵菌孢子悬液，搅拌均匀至适宜湿度，于温度25 ℃、湿度不低于95% 、光照自然的条件下，约发酵7 d至菌丝长满后适时取出，冷冻干燥即得，并低温密封保存。
2.2 ?SAPZFP、SAPZP不同截留分子量段的冻干粉制备
2.2.1 ?超滤原液的制备
根据最佳提取工艺进行超声水提（待发表资料），取“2.1”项中制备的SAPZFP约20 g，精密称定，置2 000 mL锥形瓶中，精密加入蒸馏水800 mL，调节pH值为11，于40 ℃下恒温超声提取（输入功率500 W，频率80 kHz）60 min后，在4 ℃、4 000 r·min-1条件下离心15 min，取上清液先用中速滤纸初步抽滤，以除去水不溶性杂质，再用5 μm水系微孔滤膜预处理，并重复提取一次，两次滤液合并，并加水定容至4 000 mL，即得SAPZFP的超滤原液。SAPZP同法处理作为对照。
2.2.2 ?超滤系统的预处理
将使用1%甲醛溶液密封保存于冰箱冷藏室的卷式超滤组件放至室温后，于蒸馏水中浸泡30 min，组装超滤系统，于室温、0.1 MPa条件下纯水运输30 min，以洗净超滤组件的保护剂。
2.2.3 ?超滤原液的膜分离过程
依次用已预处理的公称分子量截留值为10和5 kDa的超滤系统，于室温、0.1 MPa条件下对“2.2.1”项中SAPZFP的超滤原液进行超滤，在平衡循环4 倍原液体积后[8]，使超滤组件膜表面存在的吸附和解吸附达到平衡，进而完全超滤，得到SAPZFP的 10 kDa的超滤药液，于40 ℃旋蒸浓缩后，冷冻干燥备用。SAPZP同法制备。
2.3 ?水溶性活性成分的含量测定
2.3.1 ?水溶性氨基酸的含量测定
采用茚三酮显色法[9]进行水溶性氨基酸的含量测定。以吸光度A1为纵坐标，甘氨酸质量浓度C1（mg·mL-1）为横坐标，得甘氨酸标准曲线的回归方程为A1?= 34.756C1?- 0.006 9（R2?= 0.998 1），质量浓度在0 ～ 0.02 mg·mL-1范围内线性关系良好。分别取“2.2”项中不同截留分子量段的冻干粉约50 mg，精密称定，置100 mL容量瓶，用蒸馏水溶解定容，摇匀后精密量取5 mL置于10 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度、摇匀，得不同截留分子量段的供试品溶液，按照标准曲线绘制方法进行水溶性氨基酸的含量测定，各截留分子量段的供试品溶液平行测定3次，重复2组。
2.3.2 ?水溶性总蛋白的含量测定
采用Lowry法[10]测定水溶性总蛋白的含量，以
吸光度A2為纵坐标，以牛血清蛋白质量浓度C2
（mg·mL-1）为横坐标，得牛血清蛋白标准曲线的
回归方程为A2?= 1.839 5 C2?+ 0.004 3（R2?= 0.998 1），
质量浓度在0 ～ 0.4 mg·mL-1范围内线性关系良好。分别取“2.2”项中不同截留分子量段的冻干粉约50 mg，精密称定，置100 mL容量瓶，用蒸馏水溶解定容，得不同截留分子量段的供试品溶液，按照标准曲线绘制方法进行水溶性总蛋白的含量测定，各截留分子量段的供试品溶液平行测定3次，重复2组。
2.3.3 ?水溶性总多糖的含量测定
采用苯酚—硫酸法[11]测定水溶性总多糖的含量，以吸光度A3为纵坐标，以葡萄糖质量浓度C3（mg·mL-1）为横坐标，得葡萄糖标准曲线得回归方程为：
A3= 9.816 7C3?+ 0.019 4 （R2?= 0.998 2）
质量浓度在0 ～ 0.1 mg·mL-1范围内线性关系良好。分别取“2.2”项中不同截留分子量段的冻干粉约50 mg，精密称定，置100 mL容量瓶，用蒸馏水溶解定容，摇匀后精密量取3 mL置于25 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度、摇匀，得不同截留分子量段的供试品溶液，按照标准曲线绘制方法进行水溶性总多糖的含量测定，各截留分子量段的供试品溶液平行测定3次，重复2组。
2.4 ?SAPZFP、SAPZP不同截留分子量段的冻干粉的体外抗肿瘤研究
2.4.1 ?不同截留分子量段的冻干粉溶液的配制
取SAPZFP与SAPZP不同截留分子量段的冻干粉各约10 mg，精密称定，溶于RPMI Medium Modified培养基，配成2 mg·mL-1的初始药物浓度，无菌环境下用0.22 μm针式过滤器滤过后，用RPMI Medium Modified培养基依次2倍稀释至所需药物浓度，用于体外抗肿瘤研究。
2.4.2 ?冻干粉溶液对乳腺癌细胞株MCF - 7抑制率的测定
采用MTT法进行体外抗肿瘤研究，按照文献[12]方法接种细胞，配制阴性对照组、阳性对照组、各剂量加药组（每个剂量5个复孔），当冻干粉溶液与细胞作用24 h后，进行呈色、比色，根据OD值计算抑制率。
抑制率（%）=
[1 -（OD加药组-OD调零组）/（OD阴性对照组?- OD调零组）]×100%
2.5 ?统计学分析
全文数据均以
表示，SAPZFP与SAPZP两样本的显著性检验，在双侧F检验的基础上，进行双侧t检验。全文分析中，以P<0.05表示两样本有显著性差异，P<0.01表示有极显著性差异。同时，借助SPSS 17.0中logit模型计算体外抗肿瘤研究的IC50。
3 ?实验结果
3.1 ?SAPZFP、SAPZP不同截留分子量段的冻干粉的水溶性活性成分比较
3.1.1 ?截留分子量<5 kDa冻干粉的水溶性活性成分比较
SAPZFP与SAPZP截留分子量<5 kDa冻干粉的水溶性活性成分比较见表1。SAPZFP与SAPZP的各活性成分含量均有极显著性差异，其中SAPZFP组水溶性氨基酸、水溶性总蛋白含量较SAPZP组升高，水溶性总多糖含量较SAPZP组降低。
3.1.2 ?截留分子量5 ?～ 10 kDa冻干粉的水溶性活性成分比较
SAPZFP与SAPZP截留分子量5 kDa ～ 10 kDa冻干粉的水溶性活性成分比较见表2。SAPZFP组与SAPZP组的各活性成分含量均有极显著性差异，其中SAPZFP组水溶性氨基酸、水溶性总蛋白含量较SAPZP组升高，水溶性总多糖含量较SAPZP组降低，两组截留分子量5 ～ 10 kDa冻干粉的活性成分含量变化规律与截留分子量< 5 kDa冻干粉的活性成分含量变化规律相同。
3.1.3 ?截留分子量> 10 kDa冻干粉的水溶性活性成分比较
SAPZFP与SAPZP截留分子量> 10 kDa冻干粉的水溶性活性成分比较见表3。SAPZFP组与SAPZP组比较，水溶性氨基酸、水溶性总多糖含量升高，且具有显著性差异，而SAPZFP组与SAPZP组的水溶性总蛋白含量无显著性差异。
3.2 ?SAPZFP、SAPZP不同截留分子量段的冻干粉的体外抗肿瘤研究
3.2.1 ?截留分子量<5 kDa冻干粉对乳腺癌细胞株MCF - 7的抑制作用
SAPZFP与SAPZP截留分子量<5 kDa冻干粉对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用见表4。在各试验药物浓度下，SAPZFP组与SAPZP组对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用有显著性差异，SAPZFP组对乳腺癌细胞株MCF - 7的IC50为0.854 mg·mL-1，SAPZP组对乳腺癌细胞株MCF-7的IC50为1.128 mg·mL-1。
3.2.2 ?截留分子量5 ～ 10 kDa凍干粉对乳腺癌细胞株MCF - 7的抑制作用
SAPZFP与SAPZP截留分子量5 ～ 10 kDa冻干粉对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用见表5。在试验药物浓度（0.062 5～1 mg·mL-1）范围内，SAPZFP组与SAPZP组均对乳腺癌细胞株MCF - 7有抑制作用，且呈现量效关系。SAPZFP组对乳腺癌细胞株MCF - 7的IC50为0.315 mg·mL-1，SAPZP组对乳腺癌细胞株MCF - 7的IC50为0.360 mg·mL-1，两者具有极显著性的差异。
3.2.3 ?截留分子量> 10 kDa冻干粉对乳腺癌细胞株MCF - 7的抑制作用
SAPZFP与SAPZP截留分子量> 10 kDa冻干粉对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用见表6。SAPZFP组对乳腺癌细胞株MCF-7的IC50为0.071 mg·mL-1，SAPZP组对乳腺癌细胞株MCF-7的IC50为0.115 mg·mL-1。在试验药物浓度（0.031 25 ～ 0.5 mg·mL-1）范围内，SAPZFP组与SAPZP组对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制作用均呈现量效关系，且SAPZFP组对乳腺癌细胞株MCF-7的抑制率与SAPZP组比较，差异在各药物浓度下均具有统计学意义（P < 0.01）。
4 ?结论
超滤膜分离技术已在多领域广泛应用，其原理是依靠膜两侧压力差为驱动力，借助滤膜的微小孔径对混合体系实现目的性分离纯化和浓缩[8]。在膜分离过程中，不发生相变、无溶剂污染，能够较好保持分子的生物活性，但是，由于溶质分子形态、溶质与膜材料亲和性及架桥作用的影响，不同分子量的溶质只能被大体分开。相关研究表明，全蝎蛋白药效组分由20 ～ 80个氨基酸组成，分子量分布于3 kDa左右或6 ～ 9 kDa或大于10 kDa[3];周家容等[4]研究表明，白术多糖的分子量多分布于10 kDa以下，且< 6 kDa和10 kDa ～ 30 kDa分子量的多糖具有较好生物活性;陈振华等[5]综述中两种白头翁糖蛋白的相对分子质量均大于10 kDa。故本研究选用公称分子量截留值为10 kDa和5 kDa的超滤系统进行两步超滤研究，基本上可将主要活性成分通过超滤加以区分研究。
在各种药物的筛选中，IC50常作为标志药效的重要定量指标。文中SAPZFP与SAPZP不同截留分子量段的冻干粉均对乳腺癌细胞株MCF - 7具有抑制作用，其中截留分子量> 10 kDa冻干粉的抗肿瘤活性最强。通过比较，SAPZFP组的各分子量段的IC50均低于SAPZP组，说明球孢白僵菌双向固体发酵技术可能在提高其抗肿瘤活性方面起到了一定的作用。究其原因首先是发酵过程使球孢白僵菌形成多种极具活性的次生代谢产物和数十种胞外酶，胞外酶使药性基质的细胞破壁，可增进活性成分溶出，同时可对药性基质进行结构修饰和生物转化，从而获得活性物质。其次，球孢白僵菌产生的蛋白酶可将药性基质中的蛋白类大分子物质转化为更多小分子物质，从而产生活性更强的小分子肽类物质[13，14]。真菌在生长的过程中可利用培养基中的营养物质不断合成自身的菌丝体，这可能是提取物中多糖增加的主要来源。通过对水溶性活性成分分析可知，发酵使截留分子量 10 kDa的冻干粉水溶性氨基酸、水溶性总多糖含量升高，而水溶性总蛋白含量无显著性差异。据此推测发酵过程使大分子蛋白质部分肽键断裂，产生更多具有游离氨基的多肽类成分;且发酵过程使非糖物质转化为糖类物质，或小分子寡糖不断聚合形成更大分子量的多糖。
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