猪圆环病毒2型检测技术及研究进展

    钱坤 任连泉 王敬

    摘要：本研究对近年来猪圆环病毒2型（PCV2）抗体检测技术的研究进展进行了综述，旨在为未来的研究方向提供参考。猪圆环病毒2型是一种单股环状负链DNA病毒，具有较强的致病性，可通过呼吸道、消化道进行传播，以及由母猪传给胎儿，猪被感染后可直接导致猪群的免疫力下降，引发猪的多种疾病症状，给养猪户带来了很大的经济损失。因此，PCV2病毒感染早期诊断对猪的多种疾病综合防控意义重大，同时可保证猪肉类食品质量安全性。目前，北京、上海、南京等大城市已开始实行部分农产品市场准入制，不符合食品安全标准的各类肉、禽、畜产品将被拒绝上市销售，从而使得以便捷、及时为特点的检测方式得到快速发展。

    关键词：猪;圆环病毒2型;病毒分离;检测方法

    中图分类号：S858.28 文献标识码：B文章编号：2095-9737（2019）12-0001-03

    Abstract：The recent progress in the detection of antibodies against porcine circovirus type 2 is reviewed in this study， aiming to provide a reference for future research. Porcine circovirus type 2 （PCV2） is a single strand annular negative DNA virus. It has strong pathogenicity and can be transmitted through porcine respiratory tract， alimentary tract and sow to fetus. The infection of pigs can directly lead to the decline of immunity of pigs and cause many diseases of pigs， which brings great economic losses to pig farmers. Therefore， the early diagnosis of PCV2 infection is of great significance to the comprehensive prevention and control of various diseases in pigs， and it can also ensure the quality and safety of pork foods. With the improvement of living standard， people pay more and more attention to food safety. At present， Beijing， Shanghai， Nanjing and other big cities have begun to implement market access system for some agricultural products. All kinds of meat， poultry and livestock products that do not meet the food safety standards will be refused to be listed and sold， so that the detection methods characterized by convenience and timeliness can be developed rapidly.

    Key words：Porcine circovirus type 2; virus isolation; detection method

    1 臨床症状

    猪圆环病毒一种单股环状负链DNA病毒，是已知最小病毒之一，直径为14～25 nm[1]。对于生长发育阶段的猪，感染PCV2病毒后多诱发呼吸道综合征，临床表现为生长发育缓慢，猪贫血导致皮肤苍白、猪毛粗糙、间断性咳嗽、猪群体质变差等;皮炎、肾衰竭综合征也主要在发育阶段猪群中发生，多发于炎热的季节，临床表现为皮肤、耳部、背部常出现圆形、不规则的隆起，呈现红色或紫色，后期演变为红色结痂;对于断奶后的仔猪，感染PCV2病毒后多诱发多系统衰竭综合征，临床表现为气喘、咳嗽、日渐消瘦、食欲食量减退等;对于刚出生的仔猪，感染PCV2病毒后多诱发先天性震颤，临床表现为共济失调、震颤等症状;母猪感染PCV2病毒后，临床表现为食欲不振、精神萎靡、呼吸困难、发情延迟或不孕、流产或早产等症状[2]。由于PCV2感染诱发疾病较多，且疾病混合感染率所诱发的可能性较高，仅根据临床症状进行判断很难确诊，因此在临床表现症状的基础上仍需借助于病毒分离、血清学检测、分子生物学检测等结果加以确诊。

    2 诊断

    2.1 病毒分离法

    病毒分离是常用的方法，该方法是取PCV2感染发病猪的组织（肝脏、脾脏、肾脏、淋巴结、肺部、血液等）经磨碎、提取液混合、离心取上清、溶剂抽提等步骤，然后接种于无PCV污染的猪肾细胞系（PK-15）进行PCV2病毒的分离培养。伊秀凤[3]等采用多系统衰竭综合征症状的猪腹股沟淋巴结、肾脏组织加液氮研磨、生理盐水稀释、冻融、离心、取上清过滤，经PCR鉴定为PCV2阳性，然后取分离液接种于PK-15细胞悬液中，37℃培养，细胞形成单层后，弃去生长液加入D-氨基葡萄糖处理，处理后加入新生猪血清的DMEM维持液培养48 h获取病毒。

    2.2 免疫组化法

    徐恒[4]采用PCV1和PCV2病毒及其纯化蛋白作为抗原，首先采用IFA和ELISA筛选，得到4株杂交瘤分别与PCV1和PCV2进行反应，得到4株抗制备的腹水分别经IFA、间接ELISA法、Western-blot、免疫组化法、病毒-抗体中和试验进行检测和鉴定，结果显示1E8和5G4对组织中的PCV2抗原具有较好的反应性。施旅娟[5]等采用9头32日龄PCV2阴性的仔猪，随机分为3组，分别为对照组、PCV2接种组、PCV2接种后用钥匙孔血蓝蛋白刺激组，接种后32天取猪腹股沟浅淋巴结切片，采用免疫组化法对病毒进行定位检测，显示PCV2病毒主要存在于淋巴小结的上皮巨噬细胞中。

    2.3 抗原捕获ELISA

    2002年，McNeilly[6]等以PCV2抗体为工具，建立了抗原捕获ELISA法用于诊断猪多系统衰竭综合征，并与病毒分离、免疫组化法和PCR方法进行对比。

    2.4 PCR方法

    李婧雅[7]等采用GenBank数据库中的PCV2病毒开放阅读框2（ORF2）基因的保守序列设计了一对特异性引物。建立了检测PCV2病毒的PCR方法，并应用该检测方法对浙江省地区的142份病料进行检测，检测结果显示PCV2感染率高达56.3%。李英[8]采用针对PCV2病毒ORF2设计特异性引物，建立检测PCV2病毒的PCR检测方法，并对山东省日照市某规模化猪场患有多系统衰竭综合征的10头病猪进行PCV2的检测，结果显示7头呈现阳性。金任毛等[9]为了了解猪养殖场PCV2感染的情况，采用已建立的PCV2病毒PCR检测方法对取自广东省的7个养猪场的样本（猪淋巴结、全血、血清）进行检测，结果显示，7个养猪场阳性检出率高达100%，腹股沟淋巴结检出率最高，为85.71%，其次为全血，为72.86%，血清的检出率最低，为37.14%。

    2.5 多重PCR

    贺会利等[10]根据GenBank中报道的PCV2和PCV3病毒全基因序列，在建立各自单项PCR检测方法的基础上，筛选双重PCR最佳条件，建立PCV2和PCV3双重PCR检测方法，应用该检测方法对73份临床猪病料进行PCV2和PCV3检测，检测符合率为100%。王立娇等[11]建立一种可同时檢测PCV1和PCV2病毒的双重PCR检测方法，结果显示，双重PCR方法对PCV1和PCV2的检测灵敏度分别为1.7×103 copies/μL和4×103 copies/μL，采用该方法对2013～2017年15个猪场的145例断奶仔猪样本的检测结果显示，PCV1和PCV2阳性检出率分别为11.7 %和77.2%，与单PCR检测结果对比无显著差异。季程远等[12]根据GenBank中PCV2和PCV3的全基因组序列，设计了2对特异性引物，通过对扩增条件的优化，建立了同时检测PCV2和PCV3病毒的双重PCR检测方法，该方法可同时扩增PCV2的266 bp和PCV3的594 bp特异性片段，最低检出量均为100 copies/μL，采用该方法对广西境内的100份健康屠宰猪淋巴结样品检测，并与单一PCR进行对比，结果显示，单一和双重PCR检测结果一致，符合率均为100%。

    于静等[13]根据PCV2病毒ORF2基因保守区，设计了荧光定量聚合酶链式反应引物，利用SYBR Green作为荧光染料建立了一种定量检测PCV2的PCR方法，结果显示最低检出量为10 copies/μL，利用该方法对34份PCV2阳性临床样本进行检测，检测符合率为100%，明显高于普通PCR检测结果。郭慧娟等[14]根据PCV1和PCV2全基因序列，选取PCV2 CaP基因中相对保守而不同于PCV1的序列，设计一对SYBR Green荧光定量PCR引物，建立了一种检测PCV2的SYBR Green荧光定量PCR方法，结果显示，该方法最低检出量到10 copies/μL，比普通PCR检测方法灵敏度高1000倍。冯华等[15]采用PCV2 ORF2基因序列，构建pMD19T-ORF2重组质粒作为阳性标准品，设计特异引物，建立了一种基于SYBR Green的PCV2荧光定量PCR检测方法，结果显示，该方法检出量为3×102 copies/μL，而普通PCR检出量仅有3×104 copies/μL，采用该方法对38个样本进行检测，阳性检出率为81.5%，而常规PCR检出率仅为68.4%。

    2.6 PCR产物限制性长度多态性分析法

    郭龙军等[16]为了了解我国PCV2病毒流行毒株遗传变异情况，选用分离得到的19株PCV2毒株进行PCR扩增，采用AccⅠ和FbaⅠ内切酶对19株病毒基因PCR扩增产物进行了酶切和限制性片段长度多态性分析，该方法可以作为PCV2流行毒株分型鉴别的一种手段。

    3 结语

    病毒分离仅得到了目标病毒，仍需借助于间接免疫荧光实验（IFA）、免疫组织化学染色法、PCR或电子显微镜观察，确认病毒的分离情况。由于PCV2病毒的分离步骤繁杂费时、费力，不适用于PCV2病毒的快速诊断。间接免疫荧光试验（IFA）主要用于PCV2病毒分离效果的鉴定以及检测发生病变的组织或猪源细胞的感染情况，既可用于检测特异性的抗原，可以用于检测特异性的抗体。免疫组化法（IHC）是将动物组织或细胞中的某些化学成分提取、分离出来，以此成分作为抗原或半抗原，经免疫获取抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的抗原物质。但是，由于抗原和抗体结合形成免疫复合物无色，因此，必须经化学方法将抗原和抗体反应部位显示出来，进而对组织或细胞中的抗原进行定性、定位、定量研究。该方法的优势是可以对携带抗原的细胞、组织的大体形态进行评价，用普通显微镜在日光下就可以进行观察。

    但是，该操作比较繁琐，时间较长，而且必须在处理中去除内源过氧化物酶对反应的干扰。抗原捕获ELISA法能很好的鉴别多系统衰竭综合征和PCV2的感染，为多系统衰竭综合征和PCV2的亚临床感染的诊断提供了一种很好的检测手段。PCR一种检测速度快、特异性强、操作方便的诊断方法，随着分子生物学不断的发展，PCR在疾病病原检测中已得到了广泛的应用。PCR一种检测速度快、特异性强、操作方便的诊断方法，随着分子生物学不断的发展，PCR在疾病病原检测中已得到了广泛的应用。

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