西瓜种子败育的胚胎学观察
张超越 王迎夏 郑艳艳 战佩玉 李帆 刘林
摘? ? 要：西瓜子房产生大量胚珠，但只有部分发育为成熟种子，其余均在发育途中败育，因此用显微技术对西瓜种子败育进行了胚胎学观察。结果表明，开花当天，部分胚珠缺少胚囊，成为无胚囊胚珠，这些胚珠没有花粉管进入;部分含胚囊的胚珠也未有花粉管进入，花后1～2 d仍未有花粉管进入。授粉后10 d，部分种子无胚，部分含有球形胚，部分含有心形胚，部分含鱼雷形胚。果实成熟时，仍然有部分种子不含胚，部分含球形胚，部分含心形胚，部分含鱼雷胚，约半数含有成熟胚。显然，西瓜种子败育有3种方式：（1）胚珠不产生成熟胚囊;（2）不能实现受精作用;（3）胚在发育中途停止发育。
关键词：西瓜;种子败育;胚胎学
Abstracts： Watermelon produces a large number of ovules，about half of which develop into mature seeds while the rest abort during development. The abortion was examined by means of microscopy. At the flowering day， some ovules lacking embryo sacs were not visited by pollen tubes，and neither were some containing embryo sacs. Pollen tubes were still absent from some embryo sac-containing ovules one or two days after flowering， which underwent degeneration. In the fruits of 10 d after pollination，some seeds lacked embryos， some contained spherical embryos， some contained heart-shaped embryos， and some contained torpedo-shaped embryos. In mature fruits， some lacked embryos， some contained spherical embryos， some contained heart-shaped embryos， some contained torpedo-shaped embryos， and some contained mature embryos. In conclusion， there were three types of abortion： （a） The ovules did not produce mature embryo sacs. （b） No pollen tubes entered the embryo sac-containing ovules for fertilization. （c） The embryos aborted during seed development.
Key words： Watermelon;Seed abortion;Embryology
種子败育是农作物育种工作者非常关注的问题，种子败育与多种因素有关，花粉、胚囊、胚及胚乳等发育过程的任何一个不正常都会导致种子败育[1]，具体包括以下几种情况：（1）雄性不育，如花药退化[2]、花粉败育[3]和绒毡层发育不正常[4]。（2）雌性不育，如大孢子母细胞发育异常而不能形成胚囊[5]、珠心提早解体[6]。（3）不能实现受精作用，如花粉与柱头不亲和[7]。（4）胚在发育中途停止发育，果实成熟时种子的胚为二细胞原胚、球形胚、心形胚或鱼雷胚[8-10]，引起种胚停止发育的因素很多，如胚乳发育不正常[11]、植物激素失去平衡[12]以及营养不良等[13]。
西瓜是世界十大水果之一，栽培面积与产量相当大[14-16]。西瓜种子通常发生大量败育，尤其三倍体和四倍体种子败育更为严重，成为育种工作中的突出问题[17-18]。研究西瓜种子败育不仅具有理论意义，而且对解决育种工作中的实际问题具有参考价值。二倍体西瓜花粉发育正常，每个花药内都形成无数正常的花粉粒[19-20]，意味着种子败育的原因不在于花粉。笔者从种胚胚胎学入手探讨种子败育的机制，为解决种子败育问题提供参考。
1 材料与方法
以西瓜品种‘京欣为试验材料，种子由临沂市种子公司提供。3月初播种于营养钵，4月移栽于临沂大学实习基地，沂蒙山区丘陵地。试验于2017—2018年在临沂大学药用植物学实验室进行。
6月底至7月初从健壮植株上取样，包括开花前的雌花20个，开花当天雌花10个，花后1 d、2 d和3 d的雌花各10个，授粉后10 d幼果10个，成熟果实10个。对于花前花蕾，将其子房切成小于1 mm3的小块;对于开花当天及花后3 d的花蕾，从其子房中取出胚珠。将样品小块和胚珠先用2% 戊二醛（0.05 mol·L-1 磷酸缓冲液配制，pH 6.8）于常温下固定 12 h，然后用 1% 四氧化锇（上述磷酸缓冲液配制）于4oC 温度下再固定12 h，用10% 梯度的上行系列酒精脱水，Embed-812树脂包埋。玻璃刀切片，厚度1.5 μm，甲苯胺蓝O染色，光镜下观察胚珠的发育、开花及花后胚珠中胚囊的结构和进入珠心的花粉管。
对于授粉后10 d的幼果以及收获期的成熟果实，从中分离出所有种子，首先检查种子大小和种皮颜色，然后通过解剖并结合显微镜检查，分出正常发育种子和败育种子，并镜检败育种子中胚的发育进程。
2 结果与分析
2.1 胚珠发育
西瓜雌蕊具3心皮，3个侧膜胎座向内突入子房室，在中央会合，之后向两侧发生分支，分支产生翻卷（图1-A1）。分支末端依次产生5个胚珠原基（图1-A1～A2，B1～B2）（图1-B2），1个子房共产生1 000多个胚珠原基。显然，西瓜子房中的胚珠依次产生，同一时刻同一子房中的胚珠可能处于不同的发育阶段。
胚珠原基生长到一定阶段，向胎座末端方向稍微弯曲，呈现出背腹，曲线外方为背，曲线内方为腹。原基的腹面首先分化出珠心，然后，珠心基部分化出内珠被和外珠被。外珠被和内珠被明显不同（图1-C～E），外珠被具多层细胞，内珠被仅由两层细胞构成（图1-E～F），但内珠被比外珠被略长，故内珠被从珠孔处突出（图1-F）。
胚珠生长过程中发生接近180°弯曲，使珠孔与珠柄非常接近，形成倒生胚珠（图1-F）。大孢子母细胞与表皮之间有多层珠心细胞，即西瓜珠心为厚珠心型（图1-D～G）。
2.2 胚珠败育
珠心中发育出大孢子母细胞（图1-D～E），母细胞减数分裂产生4个大孢子，其中3个退化，1个成为功能大孢子。功能大孢子的细胞核经3次分裂产生8核胚囊，开花前胚囊细胞化，产生1个卵细胞、2个助细胞、3个反足细胞和1个中央细胞，但在1个切面上通常只能观察到部分胚囊成员（图1-F～G）。
开花当天雌蕊中的胚珠大小差异不明显，但通过对大量胚珠连续切片观察，发现胚珠的发育状态却不同：大多数胚珠都含有胚囊（图1-F～G），但也有部分胚珠缺少胚囊（图1-H1～H4）。缺少胚囊的胚珠，其珠心在花后 2 d就呈现明显退化、萎缩（图1-I1～I4，J1～J2）。显然，缺少胚囊的胚珠很快败育，不能发育成种子。缺少胚囊的胚珠位于胎座较前的位置，是发生较晚的胚珠。
花粉管是输送精子到达胚珠以完成受精作用的结构，因此观察花粉管是否进入胚珠，以了解胚珠是否受精。对开花后的胚珠进行连续切片观察，发现多数含有胚囊的胚珠有花粉管进入（图1-K～N），但也有部分含胚囊的胚珠没有花粉管进入（图1-O1～O4），缺少胚囊的胚珠全部没有花粉管进入。有花粉管进入的胚珠都是发生较早的胚珠，没有花粉管进入的胚珠都是发生较晚的胚珠。
2.3 种子败育
受精后，合子进行有丝分裂，形成单列细胞的胚柄和多细胞的胚本体，在器官分化之前，胚本体呈球形，称球形胚。当球形胚分化出子叶原基，胚本体呈心形，为心形胚。子叶原基伸长，胚本体呈鱼雷形，称鱼雷胚。当子叶、胚根等器官完全形成，胚成熟。
坐果10 d的果实，胎座呈乳白色，此时，种子大小、颜色以及胚的发育进程明显不同，可分为以下4种情况：（1）种子长度1 mm左右，没有颜色，缺少胚，胚囊合点端有卵器退化的残迹（图1-P1～P3），与开花时含有胚囊但没有花粉管进入的胚珠相对应。（2）种子长度2～3 mm（图1-Q-1号培养皿），基本没有颜色，含有球形胚，这些种子源于发生较晚的胚珠。（3）种子长5～7 mm（图1-Q-2号培养皿），种皮呈白色，含有心形胚，这些种子源于发生较晚的胚珠。（4）种子长8～9 mm（图1-Q-3号培养皿），种皮呈浅棕色，含有鱼雷胚，这些种子源于发生较早的胚珠。
果实成熟时胎座呈红色，种子仍处于不同发育阶段，如图1所示，可分为4种情况：（1）种子长1 mm左右（标示1），无色，缺少胚，与座果10 d时长度仅1 mm的种子相似，这类种子占种子总数的12.83（±7.06）%。（2）种子长约3～4 mm（标示2），白色至浅棕色，柔软，含球形胚或心形胚，与座果10天时长度2～3 mm的种子相似，这类种子占（9.27±1.72）%。（3）种子长7～8 mm（标示3），种皮软，呈棕色，含鱼雷胚，与座果10 d时長度5～7 mm的种子相似，这类种子占（29.13±2.79）%。（4）种子长9～10 mm，种皮硬，呈黑色，含有充分成熟的胚，这类种子占（48.35±7.82）%。
对比坐果10 d果实和成熟果实中的种子，显然很大一部分种子在果实发育过程中停止发育，果实成熟时胚停留在球形胚期、心形胚期或鱼雷胚期，只有不足一半种子发育成熟。
2.4 种子败育与其在胎座上位置的关系
西瓜胚珠发生的顺序性决定了胚珠发育不同步。如前文所述，西瓜雌蕊由3心皮构成，胎座从心皮愈合处产生，并向子房室中央推进，在子房室中央会合，然后产生二分支，分支发生拳卷形翻转。每一分支依次产生5个胚珠原基（图2）。由于胚珠顺序发生，早产生的胚珠较大，在发育过程中占有优势。最早发生的2个胚珠，即图2-E中第1号和第2号位上的胚珠，基本都发育为成熟种子;第3号位上的胚珠部分发育成熟，部分败育，胚停留在鱼雷胚期;第4号位上的胚珠基本不能发育为成熟种子，胚发育到心形胚或球胚期停止发育;第5号位上的胚珠通常不能产生成熟胚囊。
3 讨 论
本研究结果表明，种子败育有3种情况：（1）开花时胚珠不含胚囊，开花后珠心退化解体，不能形成种子。（2）胚珠有胚囊，但开花授粉期花粉管不进入，不能实现受精作用，无法形成种子。（3）胚停止发育，果实成熟时，胚停留在球形胚期、心形胚期或鱼雷胚期，不能发育为成熟种子。
第一种情况可能与胚珠发生的顺序性特点有关。早发生的胚珠有充分机会发育成熟，而晚发生的胚珠发育时间较短，结果在开花授粉时早发生的胚珠已经具有成熟胚囊，而晚发生的胚珠中胚囊没有机会成熟，以致退化解体。尚需更多工作来验证是否早发生胚珠中胚囊成熟时会产生抑制晚发生胚珠中胚囊发育的因子，抑制了同一子房中发育滞后的胚珠中胚囊的成熟。晚发生胚珠不产生正常的胚囊，不具有受精机会，停止发育，减少了对养分的空耗，有利于早发生胚珠向着成熟种子发育。此外，后发生的胚珠在授粉后其珠心退化，显示了胚囊发育与胚珠发育之间的相关性，胚囊正常发育是胚珠发育的重要条件。不具成熟胚囊的胚珠必然不能发育为成熟种子[7]。
第二种情况可能暗示胚囊有生理功能障碍，不产生吸引花粉管的信号物质，花粉管无法识别胚珠正确位置，无法进入胚囊以实现受精作用。没有受精的胚珠最终退化，不能形成种子。
第三种情况可能暗示发育中的种子之间存在竞争关系，胚珠发生不同步，具有早发生胚珠和晚发生胚珠，当早发生胚珠发育为成熟种子时，这些晚发生胚珠中胚的发育受到了抑制，不能达到成熟。是否成熟胚产生抑制因子抑制晚发生胚珠中胚的发育，尚有待更多工作予以证实。
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