固相萃取—高效液相色谱法测定水中苯并[a]芘、甲萘威和阿特拉津研究
摘 要：采用固相萃取-高效液相色谱法，以丙酮+二氯甲烷为洗脱剂，甲醇和水为流动相，采用梯度洗脱方法，在紫外检测器（VWD）波长220 nm，荧光检测器激发波长290 nm，发射波长430 nm的条件下，同时测定苯并[a]芘、甲萘威和阿特拉津。苯并[a]芘在0.001-0.1 mg/L、甲萘威和阿特拉津在0.1-10 mg/L范围内线性良好，方法检出限分别为0.0002、0.009、0.009 μg/L。空白水样加标回收率为69.9%～92.3%，RSD为3.3%～5.5%。
关键词：固相萃取；高效液相色谱；苯并[a]芘；甲萘威；阿特拉津
中图分类号：X132 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2018）03-0124-03
DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2018.03.072
Abstract： A method was established for determination of benzoapyrene，carbaryl and atrazine in water samples by solid phase extraction（SPE） and high performance liquid chromatograph （HPLC） using methanol-water as the mobile phase with gradient elution and acetone + dichloromethane as eluting solvent. The determination was made both on a ultraviolet detector（VWD） at the wave length of 220 nm and on a fluorescence detector （FLD） at the excitation wave length of 290 nm and emission wave length of 430 nm. The results indicated that the good linear ranges were 0.001-0.1 mg/L for benzoapyrene and 0.1-10 mg/L for carbaryl and atrazine. The determination limits of the method were 0.0002，0.009 and 0.009 μg/L for benzoapyrene， carbaryl and atrazine， respectively. The average recovery rate was 69.9%～92.3%， and the relative standard deviation was 3.3%～5.5%.
Keywards： Solid phase extraction；High performance liquid chromatography；Benzoapyrene；Carbaryl； Atrazine
苯并[a]芘是一類广泛存在于环境中的重要化学污染物，具有致癌、致畸，致突变性。苯并[a]芘具有持久性，能长久的停留在环境中，并在不同介质间相互迁移转化[1]。阿特拉津是目前应用广泛的化学除草剂，其水溶性强，在水中不可降解，进入环境后易污染水资源，有研究表明阿特拉津对水生动植物、两栖类生物、哺乳动物和人类细胞都有不同程度的损害作用[2-3]。甲萘威是一种氨基甲酸酯杀虫剂，因其杀虫谱广和毒性较低，在农业上应用颇广。甲萘威虽属于高效低毒类农药，但由于其具有水溶性，可造成生活用水的污染，长期接触甲萘威，会对人的免疫系统、神经中枢和内分泌系统造成损害。因此，找到一种能准确、快速的检测水环境中的苯并[a]芘、阿特拉津和甲萘威的方法对环境监测工作具有重大的意义。现行国家标准采用不同方法分别对苯并[a]芘、阿特拉津和甲萘威进行检测，本文通过建立固相萃取-高效液相色谱相结合的方法同时测定苯并[a]芘、阿特拉津和甲萘威，减少了三者分开检测的时间和有机溶剂的使用量，减少对环境的二次污染，为地表水环境中同时检测苯并[a]芘、阿特拉津和甲萘威提供了快速、简便的方法。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Agilent 1260系列液相色谱仪/荧光检测器（FLD）/紫外检测器（VWD）/色谱工作站（美国安捷伦公司）；C18反相柱：Agilent Eclipse XDB-C18 4.6×150 mm，5 μm；全自动固相萃取仪AUTO SPE-06C（睿科公司），Sep-Park C18固相萃取小柱（500 mg，6 mL，美国沃特斯公司）苯并[a]芘标准溶液（100 mg/L，上海洛柯仪器），甲萘威标准溶液（100 mg/L，上海洛柯仪器），阿特拉津标准溶液（100 mg/L，上海洛柯仪器），二氯甲烷（色谱纯），丙酮（色谱纯），甲醇（色谱纯），氯化钠（优级纯）。
1.2 水样的采集及保存
用棕色磨口玻璃瓶采集水样，采满并加盖密封。样品采集后应避光于4℃以下冷藏，并在7 d内萃取完毕。
1.3 样品的前处理
上样前依次用10 mL二氯甲烷，10 mL甲醇，10 mL超纯水活化C18固相萃取小柱。在1 L水样中加入5 g氯化钠，以5 mL/min的流速上样，上样后用10 mL超纯水进行淋洗，后用高纯氮气吹C18柱40 min，使柱干燥。再用10 mL二氯甲烷分两次，以1 mL/min 的速度洗脱，（或设暂停程序，手动往样品瓶中加入一定量的洗脱剂，清洗瓶壁，再设清洗样品通道程序，以1 mL/min 的速度洗脱），并收集洗脱液。在40℃下氮吹至近干，并加2 mL甲醇转溶，红外定容至1.0 mL待测。
1.4 液相色谱分析条件
梯度洗脱程序：55%甲醇+45%水，保持8 min；以15%甲醇/min的增量至85%甲醇+15%水，保持至出峰完毕。流动相流量：0.8 mL/min；柱温：40 ℃；紫外检测波长（VWD）：220 nm，荧光检测波长（FLD）：λex为290 nm，λem为430 nm，增益倍数12；进样量为10μm。
2 结果与分析
2.1 色谱条件的优化
2.1.1 检测波长的确定
甲萘威和阿特拉津检测波长参照文献[4]中甲萘威和阿特拉津的紫外检测波长为220 nm，苯并[a]芘检测波长参考文献[5]选择λex为290 nm，λem为430 nm作为荧光检测波长。
2.1.2 流动相的确定
本实验选用的流动相为甲醇和水，通过改变甲醇和水的比例，考察苯并[a]芘、甲萘威、阿特拉津的出峰时间及与样品中干扰物的分离情况。通过试验，在1.4的洗脱程序下，三者的分离效果较好，峰形尖锐。
2.1.3 柱温的优化
改变柱温，对25 ℃、30 ℃、35 ℃及40 ℃4种柱温进行比对试验，通过试验可知，随着温度的升高，三组分的保留时间缩短，峰形也越来越尖锐，峰面积虽有所减小，但并不是很明显，因此选择柱温为40 ℃，见表1。
2.1.4 流速的优化
改变流速，对0.5、0.8、1 mL/min流速进行对比试验，随着流速的增加，保留时间略微缩短，峰面积减小，从保留时间、分离度及峰形上综合考虑，选择最佳流速0.8 mL/min。
在优化好的色谱条件下，分析甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘标样，甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘出峰时间分别为：5.827 min、8.370 min、27.460 min。色谱图见图1。
2.2 固相萃取前处理条件优化
苯并[a]芘的水溶性较差，易于在样品瓶壁及管壁上吸附，其回收率较低，一般需往水样中添加有机溶剂改进剂来提高水质中苯并[a]芘的回收率。史鑫源[6]等研究发现，加入有机改进剂甲醇后，可以大大提高PAHs的回收率，其中甲醇的加入量在10%～20%回收率均较好。通过参考文献及比对试验，本文选用丙酮作为有机改进剂。分别往1 L水样中不添加丙酮、添加10 mL丙酮、添加50 mL丙酮，做比对试验。通过试验发现，当往1 L水样中添加50 mL丙酮时，苯并[a]芘回收率从不添加改进剂时的51.6%，提高到70.6%，但甲萘威及阿特拉津的回收率则从不添加改进剂时的75.5%、76.5%，减少为22.3%、23.1%。这是由于甲萘威、阿特拉津在水中的溶解度相对苯并[a]芘较大，上样时水样中添加的丙酮对两者会有一定的洗脱作用，所以导致两者的回收率大大的降低。故而在水样中添加有机改进剂对于同时萃取甲萘威、阿特拉津及苯并[a]芘不可行。
考虑到苯并[a]芘水溶性差，在样品瓶壁及管壁上吸附，因不能在水样中添加有机改进剂，故而考虑修改固相萃取前处理方法，在氮气吹干C18小柱后，加设暂停程序，手动往样品瓶中加入一定量的洗脱剂，清洗瓶壁，然后设置清洗样品通道程序，以1 mL/min 的速度，通过样品泵将洗脱剂输入C18小柱进行洗脱，并收集到样品收集管中，再进行浓缩和定容。
分别试验10 mL二氯甲烷（分两次）、15 mL二氯甲烷（分三次）和5 mL丙酮+10 mL二氯甲烷（分三次）三种洗脱剂对甲萘威、阿特拉津及苯并[a]芘回收率的影响。从表3中可以看出，用洗脱液来清洗样品瓶壁及管壁，可以大大提高苯并[a]芘回收率，回收率基本可以达到70%。而在二氯甲烷中加入丙酮，甲萘威和阿特拉津的回收率会有较大的提高。这是因为甲萘威和阿特拉津的极性较强，根据相似相溶原理，丙酮能较好的将甲萘威和拉特拉津从C18柱上洗脱下来，因为选用5 mL丙酮+10 mL二氯甲烷作为洗脱剂。
2.3 标准曲线
取甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘标液100 mg/L，用甲醇逐级稀释成甲萘威、阿特拉津浓度为0.1、0.5、1、2、4、8、10 mg/L，苯并[a]芘浓度为0.001、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.1 mg/L的混合标准溶液系列，在1.4条件下，以浓度对峰面积绘制标准曲线，得到的线性回归方程见表4。
2.4 方法检出限
在1 L空白水样中加入苯并[a]芘、甲萘威、阿特拉津标准物质各0.8 ng、30 ng、30 ng，按照优化的前处理方法及色谱法重复测定7次，根据文献[7]中方法检出限的计算方法，计算出苯并[a]芘、甲萘威、阿特拉津的检出限分别为0.0002 μg/L、0.009 μg/L、0.009 μg/L。
2.5 方法的回收率和精密度
在1 L空白水样中加入低、中、高3个浓度的混合标准溶液，按照样品处理方法进行测定，对每个浓度的加标样重复测定3次，精密度和准确度良好，回收率与RSD见表5。
2.6 样品实测结果
用上述优化方法检测漳州市五处饮用水源地水样，均未检测出甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘。
3 结论
本文通过实验建立了固相萃取-高效液相色谱同时测定水中甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘的检测方法。通过优化实验，甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘的方法检出限分别为0.009 μg/L、0.009 μg/L、0.0002 μg/L，加标回收率为69.9%～92.3%。该方法改变了以往直接用洗脱剂洗脱目标物的方法，而是先用洗脱剂清洗瓶壁及管壁，再洗脱目标物，大大提高了回收率，又可同时测定甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘，减少了现行标准用不同方法分别检测三者的检测时间，减少了有机溶剂的使用，可作为水环境中甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘检测的常用方法。
参考文献
[1]赵文昌，程金平，谢海赟等.环境中多环芳烃（PAHs）的来源与监测分析方法[J].环境科学与技术，2006，29（3）：105-107.
[2]万年升，顾续东，段舜山.阿特拉津生态毒性与生物降解的研究[J].环境科学学报，2006，26（4）： 552-560.
[3] Moom an T B. National soil tilth laboratory[M]. USA： USDA-A gricultrual Beseacreh Service，Ames，Iowa，1999.
[4]贺小敏，葛洪波，李爱民等. 固相萃取-高效液相色谱法测定水中呋喃丹、甲萘威和阿特拉津[J].环境监测管理与技术，2011，23（4）：46.
[5]環境保护部. HJ 478-2010 水质 多环芳烃的测定 液液萃取和固相萃取高效液相色谱法[S].北京：中国环境科学出版社，2010.
[6]史鑫源，王小菊，刘保献等.固相萃取-高效液相色谱法测定水质中16种多环芳烃[J].现代仪器与医疗，2014，20（6）：65-70.
[7]环境保护部. HJ 168-2010环境监测 分析方法标准制修订技术导则[S]..北京：中国环境科学出版社，2010.
收稿日期：2018-02-26
作者简介：王少蓉，女，工程师，研究生，研究方向为环境监测。
关键词：固相萃取；高效液相色谱；苯并[a]芘；甲萘威；阿特拉津
中图分类号：X132 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2018）03-0124-03
DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2018.03.072
Abstract： A method was established for determination of benzoapyrene，carbaryl and atrazine in water samples by solid phase extraction（SPE） and high performance liquid chromatograph （HPLC） using methanol-water as the mobile phase with gradient elution and acetone + dichloromethane as eluting solvent. The determination was made both on a ultraviolet detector（VWD） at the wave length of 220 nm and on a fluorescence detector （FLD） at the excitation wave length of 290 nm and emission wave length of 430 nm. The results indicated that the good linear ranges were 0.001-0.1 mg/L for benzoapyrene and 0.1-10 mg/L for carbaryl and atrazine. The determination limits of the method were 0.0002，0.009 and 0.009 μg/L for benzoapyrene， carbaryl and atrazine， respectively. The average recovery rate was 69.9%～92.3%， and the relative standard deviation was 3.3%～5.5%.
Keywards： Solid phase extraction；High performance liquid chromatography；Benzoapyrene；Carbaryl； Atrazine
苯并[a]芘是一類广泛存在于环境中的重要化学污染物，具有致癌、致畸，致突变性。苯并[a]芘具有持久性，能长久的停留在环境中，并在不同介质间相互迁移转化[1]。阿特拉津是目前应用广泛的化学除草剂，其水溶性强，在水中不可降解，进入环境后易污染水资源，有研究表明阿特拉津对水生动植物、两栖类生物、哺乳动物和人类细胞都有不同程度的损害作用[2-3]。甲萘威是一种氨基甲酸酯杀虫剂，因其杀虫谱广和毒性较低，在农业上应用颇广。甲萘威虽属于高效低毒类农药，但由于其具有水溶性，可造成生活用水的污染，长期接触甲萘威，会对人的免疫系统、神经中枢和内分泌系统造成损害。因此，找到一种能准确、快速的检测水环境中的苯并[a]芘、阿特拉津和甲萘威的方法对环境监测工作具有重大的意义。现行国家标准采用不同方法分别对苯并[a]芘、阿特拉津和甲萘威进行检测，本文通过建立固相萃取-高效液相色谱相结合的方法同时测定苯并[a]芘、阿特拉津和甲萘威，减少了三者分开检测的时间和有机溶剂的使用量，减少对环境的二次污染，为地表水环境中同时检测苯并[a]芘、阿特拉津和甲萘威提供了快速、简便的方法。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
Agilent 1260系列液相色谱仪/荧光检测器（FLD）/紫外检测器（VWD）/色谱工作站（美国安捷伦公司）；C18反相柱：Agilent Eclipse XDB-C18 4.6×150 mm，5 μm；全自动固相萃取仪AUTO SPE-06C（睿科公司），Sep-Park C18固相萃取小柱（500 mg，6 mL，美国沃特斯公司）苯并[a]芘标准溶液（100 mg/L，上海洛柯仪器），甲萘威标准溶液（100 mg/L，上海洛柯仪器），阿特拉津标准溶液（100 mg/L，上海洛柯仪器），二氯甲烷（色谱纯），丙酮（色谱纯），甲醇（色谱纯），氯化钠（优级纯）。
1.2 水样的采集及保存
用棕色磨口玻璃瓶采集水样，采满并加盖密封。样品采集后应避光于4℃以下冷藏，并在7 d内萃取完毕。
1.3 样品的前处理
上样前依次用10 mL二氯甲烷，10 mL甲醇，10 mL超纯水活化C18固相萃取小柱。在1 L水样中加入5 g氯化钠，以5 mL/min的流速上样，上样后用10 mL超纯水进行淋洗，后用高纯氮气吹C18柱40 min，使柱干燥。再用10 mL二氯甲烷分两次，以1 mL/min 的速度洗脱，（或设暂停程序，手动往样品瓶中加入一定量的洗脱剂，清洗瓶壁，再设清洗样品通道程序，以1 mL/min 的速度洗脱），并收集洗脱液。在40℃下氮吹至近干，并加2 mL甲醇转溶，红外定容至1.0 mL待测。
1.4 液相色谱分析条件
梯度洗脱程序：55%甲醇+45%水，保持8 min；以15%甲醇/min的增量至85%甲醇+15%水，保持至出峰完毕。流动相流量：0.8 mL/min；柱温：40 ℃；紫外检测波长（VWD）：220 nm，荧光检测波长（FLD）：λex为290 nm，λem为430 nm，增益倍数12；进样量为10μm。
2 结果与分析
2.1 色谱条件的优化
2.1.1 检测波长的确定
甲萘威和阿特拉津检测波长参照文献[4]中甲萘威和阿特拉津的紫外检测波长为220 nm，苯并[a]芘检测波长参考文献[5]选择λex为290 nm，λem为430 nm作为荧光检测波长。
2.1.2 流动相的确定
本实验选用的流动相为甲醇和水，通过改变甲醇和水的比例，考察苯并[a]芘、甲萘威、阿特拉津的出峰时间及与样品中干扰物的分离情况。通过试验，在1.4的洗脱程序下，三者的分离效果较好，峰形尖锐。
2.1.3 柱温的优化
改变柱温，对25 ℃、30 ℃、35 ℃及40 ℃4种柱温进行比对试验，通过试验可知，随着温度的升高，三组分的保留时间缩短，峰形也越来越尖锐，峰面积虽有所减小，但并不是很明显，因此选择柱温为40 ℃，见表1。
2.1.4 流速的优化
改变流速，对0.5、0.8、1 mL/min流速进行对比试验，随着流速的增加，保留时间略微缩短，峰面积减小，从保留时间、分离度及峰形上综合考虑，选择最佳流速0.8 mL/min。
在优化好的色谱条件下，分析甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘标样，甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘出峰时间分别为：5.827 min、8.370 min、27.460 min。色谱图见图1。
2.2 固相萃取前处理条件优化
苯并[a]芘的水溶性较差，易于在样品瓶壁及管壁上吸附，其回收率较低，一般需往水样中添加有机溶剂改进剂来提高水质中苯并[a]芘的回收率。史鑫源[6]等研究发现，加入有机改进剂甲醇后，可以大大提高PAHs的回收率，其中甲醇的加入量在10%～20%回收率均较好。通过参考文献及比对试验，本文选用丙酮作为有机改进剂。分别往1 L水样中不添加丙酮、添加10 mL丙酮、添加50 mL丙酮，做比对试验。通过试验发现，当往1 L水样中添加50 mL丙酮时，苯并[a]芘回收率从不添加改进剂时的51.6%，提高到70.6%，但甲萘威及阿特拉津的回收率则从不添加改进剂时的75.5%、76.5%，减少为22.3%、23.1%。这是由于甲萘威、阿特拉津在水中的溶解度相对苯并[a]芘较大，上样时水样中添加的丙酮对两者会有一定的洗脱作用，所以导致两者的回收率大大的降低。故而在水样中添加有机改进剂对于同时萃取甲萘威、阿特拉津及苯并[a]芘不可行。
考虑到苯并[a]芘水溶性差，在样品瓶壁及管壁上吸附，因不能在水样中添加有机改进剂，故而考虑修改固相萃取前处理方法，在氮气吹干C18小柱后，加设暂停程序，手动往样品瓶中加入一定量的洗脱剂，清洗瓶壁，然后设置清洗样品通道程序，以1 mL/min 的速度，通过样品泵将洗脱剂输入C18小柱进行洗脱，并收集到样品收集管中，再进行浓缩和定容。
分别试验10 mL二氯甲烷（分两次）、15 mL二氯甲烷（分三次）和5 mL丙酮+10 mL二氯甲烷（分三次）三种洗脱剂对甲萘威、阿特拉津及苯并[a]芘回收率的影响。从表3中可以看出，用洗脱液来清洗样品瓶壁及管壁，可以大大提高苯并[a]芘回收率，回收率基本可以达到70%。而在二氯甲烷中加入丙酮，甲萘威和阿特拉津的回收率会有较大的提高。这是因为甲萘威和阿特拉津的极性较强，根据相似相溶原理，丙酮能较好的将甲萘威和拉特拉津从C18柱上洗脱下来，因为选用5 mL丙酮+10 mL二氯甲烷作为洗脱剂。
2.3 标准曲线
取甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘标液100 mg/L，用甲醇逐级稀释成甲萘威、阿特拉津浓度为0.1、0.5、1、2、4、8、10 mg/L，苯并[a]芘浓度为0.001、0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.1 mg/L的混合标准溶液系列，在1.4条件下，以浓度对峰面积绘制标准曲线，得到的线性回归方程见表4。
2.4 方法检出限
在1 L空白水样中加入苯并[a]芘、甲萘威、阿特拉津标准物质各0.8 ng、30 ng、30 ng，按照优化的前处理方法及色谱法重复测定7次，根据文献[7]中方法检出限的计算方法，计算出苯并[a]芘、甲萘威、阿特拉津的检出限分别为0.0002 μg/L、0.009 μg/L、0.009 μg/L。
2.5 方法的回收率和精密度
在1 L空白水样中加入低、中、高3个浓度的混合标准溶液，按照样品处理方法进行测定，对每个浓度的加标样重复测定3次，精密度和准确度良好，回收率与RSD见表5。
2.6 样品实测结果
用上述优化方法检测漳州市五处饮用水源地水样，均未检测出甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘。
3 结论
本文通过实验建立了固相萃取-高效液相色谱同时测定水中甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘的检测方法。通过优化实验，甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘的方法检出限分别为0.009 μg/L、0.009 μg/L、0.0002 μg/L，加标回收率为69.9%～92.3%。该方法改变了以往直接用洗脱剂洗脱目标物的方法，而是先用洗脱剂清洗瓶壁及管壁，再洗脱目标物，大大提高了回收率，又可同时测定甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘，减少了现行标准用不同方法分别检测三者的检测时间，减少了有机溶剂的使用，可作为水环境中甲萘威、阿特拉津和苯并[a]芘检测的常用方法。
参考文献
[1]赵文昌，程金平，谢海赟等.环境中多环芳烃（PAHs）的来源与监测分析方法[J].环境科学与技术，2006，29（3）：105-107.
[2]万年升，顾续东，段舜山.阿特拉津生态毒性与生物降解的研究[J].环境科学学报，2006，26（4）： 552-560.
[3] Moom an T B. National soil tilth laboratory[M]. USA： USDA-A gricultrual Beseacreh Service，Ames，Iowa，1999.
[4]贺小敏，葛洪波，李爱民等. 固相萃取-高效液相色谱法测定水中呋喃丹、甲萘威和阿特拉津[J].环境监测管理与技术，2011，23（4）：46.
[5]環境保护部. HJ 478-2010 水质 多环芳烃的测定 液液萃取和固相萃取高效液相色谱法[S].北京：中国环境科学出版社，2010.
[6]史鑫源，王小菊，刘保献等.固相萃取-高效液相色谱法测定水质中16种多环芳烃[J].现代仪器与医疗，2014，20（6）：65-70.
[7]环境保护部. HJ 168-2010环境监测 分析方法标准制修订技术导则[S]..北京：中国环境科学出版社，2010.
收稿日期：2018-02-26
作者简介：王少蓉，女，工程师，研究生，研究方向为环境监测。
