七氟醚后处理对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠海马内磷酸化cAMP反应元件结合蛋白表达的影响
潘峰
【摘要】目的 应用七氟醚对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠进行后处理，通过观察海马内CREB（cAMP 反应元件结合蛋白）磷酸化表达的变化，探讨七氟醚后处理改善缺血缺氧性脑损伤新生大鼠远期学习记忆功能是否与加强了CREB磷酸化表达有关。方法 将18只7d龄新生SD大鼠随机分为3组：sham组、HI组、HI+2%sev组。HI组参照Balduini等方法制备改良HIBI模型，sham组实验动物不结扎左侧颈总动脉，不吸入低氧的混合湿化气体，其余操作与手术组相同，HI+2%sev 组于脑缺血缺氧后即刻吸入2%七氟醚30 min。于缺血缺氧后48小时取各组大鼠脑组织左侧海马，采用Western Blot测定各组大鼠海马内CREB磷酸化表达情况。结果 与sham组相比，HI组与HI+2%七氟醚后处理组海马组织中pCREB表达显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与缺血缺氧模型组相比，HI+2%七氟醚后处理组海马组织中pCREB表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 2%七氟醚后处理30分钟可减轻新生大鼠缺血缺氧性脑损伤的程度，其机制可能与上调CREB的磷酸化水平有关。
【关键词】七氟醚后处理;新生大鼠;缺血缺氧脑损伤;CREB
【中图分类号】R969 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095.6681.2020.28..02
CREB即cAMP反应元件结合蛋白是一种真核生物细胞核内蛋白质，其功能是调节基因的转录。CREB磷酸化（pCREB）可以调节多种基因的转录，对多项生命活动具有调控作用，尤其与细胞的生存、动物的学习记忆过程等分子神经机制密切相关[1]七氟醚后处理对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠具有神经保护作用，但其与新生大鼠海马内磷酸化cAMP反应元件结合蛋白表达的关系并未明确，本实验通过建立新生大鼠缺血缺氧性脑损伤（Hypoxic-Ischemic brain injury，HIBI）模型，应用七氟醚对其进行后处理，探讨七氟醚后处理对缺血缺氧性脑损伤的影响是否与CREB磷酸化表达增加有关。
1 材料与方法
1.1 实验分组
7 d龄SD大鼠，体重12～16 g。将大鼠随机分为3组：假手术组（sham组）;脑缺血缺氧模型组（HI组）;脑缺血缺氧+2%七氟醚后处理组（HI+2%sev组）。
1.2 模型制备
将7 d龄新生SD大鼠麻醉后，应用0.2%碘伏棉球消毒颈部皮肤，沿颈部正中线作纵行切口，解剖显微镜下分离出左侧颈总动脉，用7-0丝线两次永久结扎左侧颈总动脉，大鼠清醒后，将其放回母鼠所在籠中继续喂哺2 h，然后将实验大鼠置于自制的半密闭箱内，经进气孔向箱内持续输入2 L/min流量的8%氧气与92%氮气的湿化混合气体2 h。假手术组则不进行缺氧处理，仅呼吸室温下空气，模型组实验动物低氧处理2 h后，置于室温下自然恢复15 min后归至母鼠所在笼中继续喂哺，假手术组实验动物不结扎左侧颈总动脉，不吸入低氧的混合湿化气体，其余操作与手术组相同。
1.3 七氟醚后处理
2%七氟醚后处理组于脑缺血缺氧后即刻置于自制的半密封箱内，吸入2%七氟醚（由浓度为30%的氧气和70%的氮气输送）30 min，七氟醚后处理结束后，将实验大鼠置于自然环境下恢复至完全清醒后归于母鼠所在笼中继续喂哺。
1.4 Western Blot检测CREB磷酸化蛋白水平
七氟醚后处理48小时后，每组大鼠在深麻醉下取左侧海马，放入匀浆液中低温匀浆，15000r/min，4℃离心20 min，取上清。按Bradford法测定样本蛋白浓度后加入4倍样本缓冲液（250 mmol/L Tris /HCl，0.01%考马斯蓝亮-G，8%SDS，200 mmol/L蔗糖，和300 mmol/L Dithiothreitol，pH6.8），95℃ 5 min变性。30 μg等量的样本加在10%的SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳（120 V，1.5 h），然后电转至硝酸纤维素膜上（100 mA，2 h），5%脱脂奶粉封闭30 min后与兔抗pCREB多克隆抗体（1：400）和G-APDH兔抗大鼠抗体4℃孵育过夜，TBST冲洗3×10 min，加入碱性磷酸酶标记的羊抗兔二抗（1：1000），室温振荡孵育1 h，TBST冲洗3×10 min，ECL显色，选用GAPDH为内参蛋白，应用美国Azure凝胶成像系统获得图像。
2 结 果
与sham组相比，HI组与HI+2%sev组左侧海马组织中磷酸化CREB表达明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）;与HI组相比，HI+2%七氟醚后处理组海马组织中磷酸化CREB表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
3 结 论
2%七氟醚后处理30 min可上调缺血缺氧性脑损伤新生大鼠损伤侧海马组织中CREB的磷酸化水平，其减轻新生大鼠缺血缺氧性脑损伤可能与上调大鼠海马中CREB的磷酸化水平有关。
4 讨 论
在后处理的七氟烷的浓度上，有研究证实2.6%的吸入浓度可以产生成年大鼠1到1.5MAC值[2]，同时在7 d新生大鼠，通过钳夹尾部中段，观察体动来判断，2%七氟烷的吸入浓度可以产生1MAC值[3]。同时，就后处理的吸入浓度上，已有文献证实，1到1.5MAC可产生保护作用。所以本研究选择吸入2%七氟烷后处理30 min，产生1MAC的麻醉效果。CREB磷酸化（pCREB）可以调节多种基因的转录，对多项生命活动具有调控作用，尤其与细胞的生存、动物的学习记忆过程等分子神经机制密切相关。大脑中的海马区是与记忆活动密切相关的区域，早期研究表明小鼠海马区长时程记忆增强是转录依赖性的，之后又有研究指出，在海马神经原中加强凋节NMKA受体，也依赖CREB的磷酸化。CREB作为一种核内转录因子，磷酸化后能够激活或促进一系列与学习记忆相关的基因表达，表达长时间记忆相关蛋白，在短时间记忆转变为长时间记忆过程中起到关键的分子开关作用。本研究结果显示CREB磷酸化水平的升高可能参与介导七氟烷后处理引起HIBI新生大鼠学习记忆能力的改善。七氟醚后处理的神经保护作用有很多可能的机制参与，其机理极其复杂，本实验仅就CREB磷酸化表达的变化进行了探讨，具体的信号转导过程以及可能的机制还有待进一步研究。
参考文献
[1] Costa-Mattioli M，Gobert D，Harding H，et a1.Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the elF2alpha kinase GCN2.Nature，2005，436（7054）：l166一l173
[2] Bo Lia，JianSuna，GuoyiLva.Sevofluranepostconditioning attenuates cerebral ischemia-reperfusion injury via protein kinase B/nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 pathway activation. Int.J.Devl Neuroscience.2014，（38）：79–86
[3] Lin EP，Miles L，Hughes EA， et al.A Combination of Mild Hypothermia and Sevoflurane Affords Long-Term Protection in a Modified Neonatal Mouse Model of Cerebral Hypoxia-Ischemia[J].Anesth Analg.2014，119（5）：1158-1173.
