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二氧化钛纳米管负载蒲公英多糖对牙龈卟啉单胞菌活性的影响

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罗琴琪李潇

[摘要]目的：通过阳极氧化二氧化钛纳米管负载不同浓度的蒲公英多糖，研究该复合涂层对牙龈卟啉单胞菌活性的影响，评价其抗菌性能。方法：设置阳极二氧化钛片为对照组（A组），阳极二氧化钛片负载不同浓度的蒲公英多糖为实验组：多糖浓度50mg/ml（B组），100mg/ml（C组），200mg/ml（D组）。场发射扫描电镜（FESEM）观察钛片表面形貌结构，X射线光电子能谱仪（XPS）检测钛片表面元素组成，台盼蓝染色荧光显微镜下计数活菌/死菌比例数。结果：FESEM下观察到各组钛片表面管径均一的纳米管阵列，管径80～100nm，实验组纳米管表面可见白色粟粒状颗粒沉积，D组>C组>B组;XPS显示C含量显著增加，特征性C峰值增高，D组>C组>B组;台盼蓝染色镜下观察牙龈卟啉单胞菌活菌呈现透明，死菌被染成蓝色，单视野下死菌数量D组>C组>B组>A组，细菌活性（活菌/死菌×100%）D组 [关键词]二氧化钛纳米管;蒲公英多糖;牙龈卟啉单胞菌;抗菌效应

[中图分类号]R781.4+2? ? [文献标志码]A? ? [文章编号]1008-6455（2019）08-0109-03

牙科种植修复已经成为牙列缺损或牙列缺失的一种常规治疗手段，纯钛及其合金作为种植体材料具有良好的生物相容性。随着口腔种植研究的不断发展，简化治疗流程，缩短治疗时间，提高种植手术的远期成功率是目前最为关注的问题。其根本解决办法是对种植体表面进行生化改性，以期加快形成种植体骨结合，早期功能负载，有效降低术后种植体周围炎的发生率。

随着现代纳米技术的发展，构建微纳米仿生表面形貌已逐步应用到钛种植体表面的处理。阳极氧化技术（anodizing technology）是一种比较成熟的金属表面改性方法，能在金属表面形成纳米级管状结构的氧化涂层。采用阳极氧化法制备的二氧化钛纳米管阵列比表面积大、吸附能力强、生物相容性好，具有一定的抑菌性能，可作为载体进行药物传送和加载生物活性因子[1-3]。蒲公英多糖（dandelion polysaccharide）是蒲公英植物的提取物之一，也是蒲公英的主要活性成分之一，蒲公英多糖具有抗菌、抗氧化、抗突变、抗疲劳、增强免疫、调节激素等多种药理作用[4]，尤以抗菌效应最为突出。孙继梅等[5]采用微量肉汤稀释法对临床常见的203株分离菌进行体外最小抑菌浓度测定，结果提示蒲公英对临床常见的革兰氏阳性、阴性球菌均有较好抑菌活性。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）是牙周组织感染中最重要的致病菌，目前公认菌斑聚集是导致种植体周围炎的始动因子，尤以牙龈卟啉单胞菌多见。潘在兴等[6]通过对种植体植入患者的龈沟菌斑标本进行检测，研究发现牙龈卟啉单胞菌可能是影响种植体周围骨重建，导致边缘骨吸收的原因之一。

本研究拟采用阳极氧化技术制备二氧化钛纳米管，通过简单的物理吸附法负载不同浓度的蒲公英多糖，体外与牙龈卟啉单胞菌共培养，探索该复合涂层的抗菌性能，以期为钛种植体表面生化改性提供一定的依据。

1? ?材料和方法

1.1 主要实验材料及设备：纯钛片（99.99%，陕西宝鸡鹏润新金属材料有限公司）、蒲公英多糖（95%，陕西慈缘生物技术有限公司）、牙龈卟啉单胞菌（广东省微生物研究所）、台盼蓝（北京雷根生物技术有限公司）、BHI血琼脂平板（广东环凯微生物科技有限公司）、直流恒压电源（DPM8600，杭州钧策器械股份有限公司）、厌氧工作站（上海万锐实验室设备有限公司）、场发射扫描电镜（Merlin，德国）、X射线光电子能谱仪（THERMO FISHER SCIENTIFIC，美国）、倒置荧光显微镜（OLYMPUS，日本）

1.2 实验方法

1.2.1 二氧化钛纳米管的制备：商业圆形纯钛片（10mm×

10mm×1mm）依次经800#、1000#、1200#鹰派砂纸打磨，丙酮、乙醇、去离子水超声清洗，每次15min，空气中干燥備用。在玻璃烧杯中配制300ml电解液（乙二醇97vol%、氟化铵0.5wt%、水3vol%）。连接直流恒压电源，将钛片置于阳极，铂片置于阴极，设置氧化电压20V，氧化时间2h。氧化完成后钛片置于450℃高温马弗炉中烧结3h，乙醇、去离子水超声清洗，每次5min，钛片清洗完成后置于烘烤箱中干燥备用。

1.2.2 蒲公英多糖的负载与实验分组：称取一定量的蒲公英多糖粉末溶于无水乙醇/DMSO （DMSO<1vol%），分别配制浓度为50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml的蒲公英多糖溶液。将阳极氧化处理的钛片分别置于三种不同浓度的多糖溶液，超声振荡处理30min。去离子水漂洗钛片，去除表面未负载的多糖，空气中干燥备用。设置阳极氧化钛片为对照组（A组），阳极氧化钛片负载不同浓度的蒲公英多糖为实验组：多糖浓度50mg/ml（B组），100mg/ml（C组），200mg/ml（D组）。

1.2.3 实验钛片表征测试：场发射扫描电镜观察试件表面形貌;X射线光电子能谱分析检测试件表面元素组成。

1.2.4 牙龈卟啉单胞菌（Pg）的厌氧培养：自液氮罐内取出冻存的牙龈卟啉单胞菌，复苏于BHI血琼脂平板（30%牛脑心浸出液、10%琼脂、10%氯化血红素+维生素K1溶液、10%脱纤维羊血），置于37℃厌氧工作站（80% N2、10% CO2、10% H2）培养4～5d。将BHI血琼脂平板上生长状态良好的细菌（表面光滑的黑色球形菌落）接种于BHI液体培养基，厌氧工作站中培养2d扩增菌种。用细菌浊度仪配制密度1×106CFU/ml的菌悬液，分别吸取500?l菌悬液接种于孔板内钛片上，“+”字摇匀后放入工作站中厌氧培养48h。

1.2.5 牙龈卟啉单胞菌（Pg）活性检测：取出孔板，弃上清液，PBS漂洗两遍，用细胞刮分别从钛片上刮取细菌至EP管，加入新鲜PBS重悬细菌。分别吸取180?l菌悬液至12孔板，加入0.4%的台盼蓝染液20?l，“+”字摇匀。荧光显微镜下观察细菌染色情况，计算活/死菌比例。

1.3 统计学分析：采用SPSS 13.0统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x?±s）的形式呈现，采用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）和SNK-q检验;计数资料以百分率（%）的形式呈现，采用多个样本率比较的卡方检验（χ2）。假设检验采用双侧检验，检验水准ɑ=0.05，P<0.05时差异有统计学意义。

2? 结果

2.1 试件表面形貌：FESEM结果：对照A组钛片表面可见管径均匀的纳米管阵列，纳米管管壁光滑，直径约80～100nm（图1a）。实验组（B、C、D组）钛片表面可见纳米管表面及管内有白色粟粒状颗粒物沉积（图1b、图1c、图1d）。图中可以看出颗粒物的量与负载蒲公英多糖的浓度呈正相关，D组>C组>B组。

2.2 试件表面元素分析：XPS检测结果：实验组（B、C、D组）和对照组（A组）钛片表面均含有C、N、O元素，实验组特征性C元素峰值显著增高，且与负载蒲公英多糖的浓度呈正相关，D组>C组>B组。

2.3 牙龈卟啉单胞菌（Pg）台盼蓝染色：台盼蓝染色结果：荧光显微镜下观察活菌呈现透明，死菌被染成蓝色。实验组（B、C、D组）钛片表面死菌数量显著高于对照组（A组），各实验组间钛片表面死菌数量与负载蒲公英多糖的浓度呈正相关，D组>C组>B组。

2.4 牙龈卟啉单胞菌（Pg）活性：根据公式：细菌活性（活细菌率%）=活细菌总数/（活细菌总数+死细菌总数）×100%，计算四组钛片表面细菌活性，得出细菌活性D组 3? 讨论

3.1 二氧化钛纳米管负载蒲公英多糖复合涂层的制备：随着现代纳米技术的发展，材料表面纳米化改性已成为增加钛种植体表面粗糙度的一种优良方法。有学阵列者研究表明，采用乙二醇-氟化铵水溶液为电解液，阳极氧化电压为20V，氧化时间为2h的条件下，可制备出高度有序的TNTs[7-8]。本实验采用相同的氧化参数成功在钛片表面制备出二氧化钛纳米管，场发射扫描电镜下观察纳米管结构规整，直径约80～100nm，管壁光滑，实验结果与以往研究相一致。

本研究采用简单的物理吸附法加载蒲公英多糖在钛片表面纳米管上，与其他生化改性方法相比，该负载方式保证了材料及活性分子的化学结构和生物性能。对于多糖的微观检测，本研究在扫描电镜下观察到实验组钛片纳米管表面及内部有粟粒状颗粒物沉积，沉积量与多糖浓度成正相关;XPS检测到实验组钛片表面特征性C元素峰值显著增高，且峰值与多糖浓度成正相关。两种检测方法直接定性证实蒲公英多糖的成功负载，为该实验方案的后续实施奠定了基础。本研究未对多糖负载作定量测定，故未能得到负载量与多糖浓度关系的精确数据支持，这也是本研究有待进一步完善的地方。

3.2 二氧化钛纳米管负载蒲公英多糖复合涂层的抗菌性：目前公认菌斑聚集是导致种植体周围炎的始动因子，聚集在种植体周围的菌斑主要为革兰氏阴性厌氧菌，尤其是牙龈卟啉单胞菌[9-10]。为了研究蒲公英多糖改性的纳米管的抗菌性，本研究选定了牙龈卟啉单胞菌为研究对象。实验采用台盼蓝染色法检测牙龈卟啉单胞菌活性，正常活菌胞膜结构完整，排斥台盼蓝染液进入菌体，当细菌活性丧失，胞膜通透性增加，因而被染成蓝色。本实验结果显示，染色后显微镜下观察到实验组钛片表面死菌数量显著高于对照组（P<0.05），实验组中负载高浓度多糖的納米管表面死菌数量高于负载中浓度多糖的纳米管（P>0.05）和负载低浓度多糖的纳米管（P<0.05），可以得出二氧化钛纳米管负载蒲公英多糖复合涂层对牙龈卟啉单胞菌具有较强的抗菌性，在一定范围内，抗菌活性与蒲公英多糖浓度成正相关关系。关于蒲公英多糖的抗菌机制，有研究表明，蒲公英多糖可抑制细菌细胞壁的合成，促使细胞壁破裂，还能抑制DNA和蛋白质的合成[11-12]。有关蒲公英多糖抑制牙龈卟啉单胞菌活性的具体作用机制尚不清楚，有待后续实验进一步研究。

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[收稿日期]2019-02-12

本文引用格式：罗琴琪，李潇.二氧化钛纳米管负载蒲公英多糖对牙龈卟啉单胞菌活性的影响[J].中国美容医学，2019，28（8）：109-112.

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