| 标题 | 苦参碱对人膀胱癌BIU—87/ADM细胞多药耐药的影响 |
| 范文 | 左陵君 张耘新 段建敏 摘要：目的 探讨苦参碱对人膀胱癌BIU-87/ADM细胞多药耐药逆转作用的机制。方法 MTT法检测细胞生长抑制率；荧光分光光度计检测阿霉素（ADM）的蓄积和外排；免疫印迹法检测P-糖蛋白（P-gp）表达；P-gp-GloTMAssay System试剂盒检测P-gp ATP酶活性。结果 经ADM作用后，与敏感细胞株BIU-87存活率比较，耐药细胞株BIU-87/ADM存活率明显增加（P<0.001），苦参碱呈剂量依赖地降低BIU-87/ADM细胞存活率（P<0.01），而对敏感细胞株BIU-87细胞存活率无显著影响。苦参碱呈剂量依赖地增加ADM在BIU-87/ADM细胞中蓄积水平，抑制ADM细胞内外排。苦参碱明显抑制P-gp蛋白表达，降低P-gp ATP酶活性。结论 苦参碱通过抑制BIU-87/ADM细胞P-gp蛋白和ATP酶活性，减弱P-gp外排功能，增加细胞内ADM蓄积，从而发挥对人膀胱癌BIU-87/ADM细胞多药耐药的逆转作用。 关键词：苦参碱；BIU-87/ADM细胞；多药耐药；逆转 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.02.020 中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）02-0073-03 Effects of Matrine on Multidrug Resistance of Human Bladder Cancer BIU-87/ADM Cells ZUO Ling-jun， ZHANG Yun-xin， DUAN Jian-min （Department of Urology Surgery， The Second Hospital Affiliated to Lanzhou University， Lanzhou 730030， China） Abstract： Objective To investigate the reversal mechanism of matrine on multidrug resistance （MDR） in BIU-87/ADM cells. Methods The cell proliferation inhibition rate was detected by MTT assay； the accumulation and efflux of ADM was detected by fluorescence spectrophotometer； the expression of P-gp protein was tested by Western blot； the activity of P-gp ATPase was measured by P-gp-GloTM Assay System kit. Results Compared with the sensitive cell line BIU-87， the survival rate of multidrug resistant cell line BIU-87/ADM was significantly increased after treated with ADM （P<0.001）； matrine reduced the survival rate of BIU-87/ADM cells with a manner of dose-dependently （P<0.01）， without significant effect on the BIU-87 cell. Matrine increased accumulation of ADM and inhibited P-gp-mediated efflux of ADM. Matrine decreased the expression of P-gp and inhibited the activity of P-gp ATPase significantly. Conclusion Matrine can reverse multidrug resistance in BIU-87/ADM cells by inhibiting the expression of P-gp and ATPase activity， reducing P-gp-mediated efflux of ADM， and increasing accumulation of ADM to play the role in reversal effects on multidrug resistance of human bladder cancer BIU-87/ADM cells. Key words： matrine； BIU-87/ADM cells； multidrug resistance； reversal 肿瘤细胞的多药耐药（multidrug resistance， MDR）是导致肿瘤化疗失败主要原因之一。目前研究表明，细胞膜上P-糖蛋白（P-gp）的过度表达及P-gp ATP酶活性升高是肿瘤细胞产生MDR的主要机制[1-2]。苦参碱作为苦参的主要活性成分，具有明显的化疗增敏作用，目前已广泛用于肿瘤的辅助治疗[3-6]，但对人膀胱癌阿霉素（ADM）耐药是否具有逆转作用，目前尚不清楚。本实验拟探讨苦参碱对人膀胱癌BIU-87/ADM耐药细胞的逆转作用及其机制， 基金项目：甘肃省自然科学研究基金计划（145RJYA256） 以期为其临床应用提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 细胞 人膀胱癌BIU-87细胞及BIU-87/ADM耐药细胞由四川大学华西医院泌尿外科赠送，兰州大学第二医院泌尿外科研究所保藏。 1.2 主要试剂与仪器 RPMI1640培养基（北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司），胎牛血清、MTT（美国Sigma公司），RIPA裂解液、Bradford蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所），P-gp抗体、β-actin抗体（美国Santa Cruz公司），HRP偶联羊抗鼠二抗（北京中杉金桥公司），P-gp-GloTM Assay System试剂检测盒（美国Promega公司）；CO2培养箱、全波长Multiskan Spectrum酶标仪（美国Thermo公司），荧光光度计（RF-5301PC，日本岛津）。 1.3 药物 苦参碱注射液，山西振东泰盛制药有限公司，批号130120；注射用盐酸多柔比星，山西普德药业有限公司，批号1211-1。 1.4 细胞存活率检测 取对数生长期人膀胱癌BIU-87细胞及BIU-87/ ADM耐药细胞接种于96孔培养板，培养24 h后加不同浓度苦参碱（0.5、1.0、2.0 ?g/mL）和10 ?g/mL ADM，对照组在培养体系中加同浓度DMSO。37 ℃、5%CO2培养48 h后弃培养基，各孔加5 mg/mL MTT 20 ?L，继续孵育4 h。弃培养基，每孔加DMSO 200 ?L，待溶解显色后于酶标仪570 nm波长处测定OD值，计算细胞存活率（实验组平均OD值÷对照组平均OD值×100%）。所有实验均重复3次。 1.5 阿霉素蓄积检测 参考文献[2，7]方法，通过检测ADM自发荧光强度反映ADM的蓄积程度。收集1×106 BIU-87/ADM细胞，与不同浓度苦参碱或DMSO于37 ℃孵育1 h加10 ?g/mL ADM孵育3 h。冷PBS洗涤细胞3次后，重悬收集细胞，荧光光度计检测分析相同数目细胞的荧光强度，激发波长480 nm，发射波长570 nm，并计算相对荧光强度值。 1.6 阿霉素外排检测 加含10 ?g/mL ADM的培养液与细胞孵育3 h后，弃培养基。加不同浓度苦参碱或DMSO培养液后，继续孵育1 h。冷PBS洗涤3次后，重悬收集细胞，荧光光度计检测。 1.7 Western blot检测 按“1.4”项处理细胞24 h后收集细胞，PBS洗涤加蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA细胞裂解液提取总蛋白。Bradford法蛋白定量，上样量30 ?g，10%SDS-PAGE进行电泳2.5 h。PVDF膜转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗（1∶1000稀释）4 ℃孵育过夜；1×TBST洗涤3×10 min。二抗（1∶2000稀释）37 ℃孵育2 h，1×TBST洗涤3×10 min。ECL显色法进行检测。采用软件Image pro plus 6.0比较条带的积分光密度。 1.8 P-糖蛋白ATP酶检测 严格按P-gp-GloTM Assay System试剂盒使用说明书进行检测。 1.9 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析，组间均数多重比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。 2 结果 2.1 苦参碱逆转BIU-87/ADM细胞对阿霉素耐药性的影响 经ADM作用后，与敏感细胞株BIU-87存活率比较，耐药细胞株BIU-87/ADM存活率明显增加（P<0.001），即BIU-87/ADM细胞对ADM表现出明显的耐药性。预实验结果显示，苦参碱单独作用于BIU-87/ADM细胞的IC50为32.5 ?g/mL，本实验选取对BIU-87/ADM细胞无明显细胞毒作用的剂量0.5，1.0、2.0 ?g/mL。结果显示，苦参碱呈剂量依赖地降低BIU-87/ADM细胞存活率，即有效地逆转BIU-87/ADM细胞对ADM的耐药性，而对敏感细胞株BIU-87细胞存活率无显著影响，见表1。 2.2 苦参碱对阿霉素BIU-87/ADM细胞内蓄积的影响 预先未加苦参碱，单纯ADM作用后，BIU-87/ ADM细胞内ADM的荧光强度较弱，即ADM蓄积水平较低。苦参碱呈剂量依赖地增加ADM在BIU-87/ADM细胞中蓄积水平，见表2。 2.3 苦参碱对阿霉素BIU-87/ADM细胞内外排的影响 经ADM孵育BIU-87/ADM细胞3 h后，再加不同浓度苦参碱或DMSO。结果显示，溶剂组BIU-87/ADM细胞内荧光强度较低，即ADM外排较多；苦参碱明显增加细胞内荧光强度，即抑制ADM的外排，见表3。 2.4 苦参碱对BIU-87/ADM细胞P-糖蛋白表达及其ATP酶活性的影响 苦参碱明显抑制BIU-87/ADM细胞P-gp蛋白表达（见图1），并呈剂量依赖地抑制P-gp ATP酶活性，见表4。 3 讨论 人膀胱癌BIU-87/ADM耐药细胞模型是研究膀胱癌多药耐药的最常用模型之一[8]。本研究通过建立该模型评价苦参碱对BIU-87/ADM耐药的逆转作用，结果显示，苦参碱可剂量依赖地逆转BIU-87/ADM细胞对ADM的耐药性。 P-gp具有ATP依赖性“药泵”功能，通过与ATP结合将细胞内药物转移至细胞外，减少药物蓄积，降低细胞内的药物浓度，从而导致细胞产生耐药性。本实验结果显示，苦参碱能显著抑制ADM外排，增加ADM在BIU-87/ADM细胞中蓄积水平，这提示苦参碱对BIU-87/ADM耐药的逆转作用可能与调节P-gp蛋白表达有关。进一步Western blot实验发现，苦参碱呈剂量依赖地抑制P-gp蛋白表达，验证了上述推断，即苦参碱通过抑制P-gp蛋白表达，减少ADM外排，增加ADM在BIU-87/ADM细胞中蓄积水平，从而发挥其对BIU-87/ADM耐药的逆转作用。 一般认为，P-gp药物外排作用与ATP的水解相偶联，所以P-gp底物可诱导ATP酶活性。本研究发现，在BIU-87/ADM耐药细胞株中ADM能明显增加P-gp ATP酶活性，即ADM为P-gp底物，这与前人报道一致[9]。同时，我们发现苦参碱能抑制BIU-87/ADM耐药细胞株中P-gp ATP酶活性。 综上，苦参碱对BIU-87/ADM细胞耐ADM具有较强的逆转作用，其机制是通过抑制P-gp蛋白表达，降低P-gp ATP酶活性，减少P-gp外排作用，从而增加ADM在细胞内的蓄积。 参考文献： [1] GILLET J P， GOTTESMAN M M. Mechanisms of multidrug resistance in cancer[M]. New Jersey：Humana Press，2010：47-76. [2] MICHAELIS M， ROTHWEILER F， KLASSERT D， et al. Reversal of P-glycoprotein–mediated multidrug resistance by the murine double minute 2 antagonist nutlin-3[J]. Cancer research，2009， 69（2）：416-421. [3] 曹晟丞，张海盛，柳江英.复方苦参注射液对卵巢癌化疗患者免疫功能及生存质量的影响[J].中国中医药信息杂志，2015，22（8）：35-37. [4] 王磊，李灵招，王晓芳，等.复方苦参注射液联合伽玛刀治疗局部晚期胰腺癌临床研究[J].中国中医药信息杂志，2015，22（6）：21-24. [5] 魏有刚.复方苦参注射液联合盐酸羟考酮治疗肺癌疼痛疗效观察[J].中国中医药信息杂志，2015，22（10）：28-30. [6] 曹亮，郭彦伟，王志伟，等.复方苦参注射液防治肝动脉栓塞化疗术对中晚期肝癌患者肝损害临床观察[J].中国中医药信息杂志，2014，21（6）：98- 99. [7] TANG X， GU X， REN Z， et al. Synthesis and evaluation of substituted dibenzo[c，e]azepine-5-ones as P-glycoprotein- mediated multidrug resistance reversal agents[J]. Bioorg Med Chem Lett，2012，2（8）：2675-2680. [8] 林劲权，周辉良，蔡卫平.mdrl shRNA逆转膀胱癌耐药细胞株BIU-87/ ADM对ADM的耐药性[J].现代泌尿生殖肿瘤杂志，2013，5（6）：356-359. [9] 王磊，柯红，王一羽，等.姜黄素逆转P糖蛋白介导的膀胱肿瘤多药耐药的实验研究[J].时珍国医国药，2009，20（3）：101-103. （收稿日期：2015-04-21） （修回日期：2015-05-30；编辑：华强） |
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