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标题 热补针法干预风湿性关节炎寒证模型家兔尿液代谢组学研究?
范文 袁博 王金海 张星华 田亮 任朝展 杜小正


摘要：目的 通过对风湿性关节炎（RA）寒证模型家兔尿液中内源性代谢物的分析，探讨热补针法治疗RA的特异性机制。方法 采用卵蛋白诱导联合低温冷冻建立RA寒证家兔模型。将40只清洁级青紫蓝家兔随机分为正常组、模型组、平补平泻组、捻转补法组、热补针法组，每组8只。分别应用平补平泻、捻转补法、热补针法针刺“足三里”，1次/d，留针30 min，共7 d。干预结束后收集新鲜尿液，气相色谱-四级杆飞行时间质谱采集各组尿液代谢物图谱，利用主成分分析和偏最小二乘判别分析对数据进行统计。结果 与正常组比较，模型组尿液代谢物变化显著，氨基酸代谢相关物质降低，三羧酸循环、糖类代谢、脂肪酸代谢相关物质增高；与模型组比较，各针刺组三羧酸循环、脂质代谢相关物质降低（P<0.05）；热补针法组三羧酸循环相关物质明显低于平补平泻组和捻转补法组（P<0.05）。结论 热补针法治疗RA的特异性体现在对三羧酸循环的调控。
关键词：热补针法；风湿性关节炎；代谢组学；系统生物学；气相色谱-四级杆飞行时间质谱；兔
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.12.016
中图分类号：R245 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）12-0064-05
Study on Intervention of Heat-reinforcing Needling for Metabonomics of Rabbits Urine with Rheumatoid Arthritis Cold Syndrome YUAN Bo1， WANG Jin-hai2， ZHANG Xing-hua1， TIAN Liang1， REN Chao-zhan3， DU Xiao-zheng1 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. The Second Hospital of Lanzhou University， Lanzhou 730030， China； 3. Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730050， China）
Abstract： Objective To analyze the endogenous metabolites in urine of rabbits with rheumatoid arthritis （RA） cold syndrome； To investigate the specificity mechanisms of heat-reinforcing needling for RA. Methods Egg albumin inducing method combined with low temperature and freezing method was used to establish RA cold syndrome rabbit models. A total of 40 healthy purple blue rabbits were randomly divided into normal control group （NC）， model control （MC）， reinforcing-reducing needling group （RRN）， twirling-reinforcing needling group （TRN） and heat-reinforcing needling group （HRN） （n=8/group）. Except NC and MC， RRN was given acupuncture of reinforcing-reducing needling at Zusanli （ST36）， TRN was given acupuncture of twirling-reinforcing needling at Zusanli， and HRN was administrated acupuncture of heat-reinforcing needling at Zusanli， once a day and retaining 30 min， a total of seven days. Fresh urine sample after the intervention was collected and then gas chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry technology were used to evaluate metabolic profiles. All the data were analyzed by principal component analysis and partial least squares discriminant analysis. Results Compared with NC， the urine metabolites of MC changed significantly， mainly reflecting in the increase of amino acid metabolism were decreased， metabolites of TCA cycle， carbohydrate and fatty acid metabolism were increased； Compared with MC， the urine metabolites of TCA cycle and fatty acid metabolism were decreased in all intervention of acupuncture group （P<0.05）， but the metabolites of TCA cycle in HRN were obviously less than that of RRN and TRN （P<0.05）. Conclusion The specificity of heat-reinforcing needling for RA manifests in regulation of TCA cycle.
Key words： heat-reinforcing needling； rheumatoid arthritis； metabonomics； systems biology； GC-Q/TOF-MS； rabbits
基金项目：国家自然科学基金（81260558）；甘肃省自然科学基金（1208RJZA185）；甘肃省高校基本科研业务费项目（2011年）
通讯作者：杜小正，E-mail：lz-duxiaozheng@163.com
风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种自身免疫性疾病。目前尚无根治方法，针灸具有抗炎、免疫调节等作用[1-3]，对RA具有确切的临床疗效[4]。热补针法是郑魁山教授简化烧山火手法和进火法而形成的一种复式手法，具有补益正气、温阳散寒功效。课题组前期研究表明，热补针法在治疗RA过程中具有相对特异性的效果[5-8]。但前期研究仅从镇痛方面进行了初步分析，缺乏对针刺后机体产生的全部生物信息的综合分析。
代谢组学是一种能够反映生物系统中所有低分子量（<1000）代谢物质的定性和定量分析手段，通过考察生物体系终末代谢产物的变化，研究生物体系代谢途径[9-10]。气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术是最早应用于代谢组学的色质联用技术，除具有较高的分辨率和检测灵敏度外，还具有用来参考比较的标准代谢物谱库。因此，该研究手段的优势与针灸作用特点甚相吻合。为了进一步探讨热补针法治疗RA的特异性机制，本研究以RA模型家兔为载体，采用气相色谱-四极杆飞行时间质谱（GC-Q/TOF-MS）从系统生物学角度探讨热补针法治疗RA的特异性机制。
1 材料与方法
1.1 动物
2～3月龄清洁级健康青紫蓝家兔40只，雌雄各半，体质量（2.5±0.5）kg，兰州生物制品研究所，许可证号SCXK（甘）2012-0001。饲养于温度（20±2）℃，相对湿度（50±10）%，每日光照时间12 h，自由进食饮水。
1.2 针具、主要试剂与仪器
针灸针（华成牌，苏州东邦医疗器械有限公司）。卵蛋白干粉（批号A5253-250G）、弗氏完全佐剂（批号F5881），Sigma公司。甲醇、吡啶，国药集团；尿素酶、甲氧胺盐酸吡，Sigma公司。Agilent 7890A/5975C GC/MS系统、毛细管色谱柱（HP-5 ms Agilent），J&W; Scientific公司。
1.3 分组及造模
家兔适应性饲养7 d，随机分为正常组、模型组、平补平泻组、捻转补法组、热补针法组，每组8只。采用卵蛋白诱导联合低温冷冻进行RA寒证模型复制[11-12]。实验正式开始前3 d，用电推剃去家兔背部肩胛骨间的毛。将4 mg/mL卵蛋白溶液与等量弗氏完全佐剂混匀，充分震荡成乳化剂，2%碘酒、75%乙醇消毒肩背部均匀选定的6个点，每点皮下注射0.2 mL。14 d后以相同方式、相同剂量重复皮下注射1次。第2次免疫后6 d，剃去家兔双后腿膝关节周围的毛，2%碘酒、75%乙醇消毒双膝关节，关节内注入20 mg/mL卵蛋白生理盐水溶液0.4 mL。24 h内膝关节出现红肿触痛，表明模型复制成功。成模后第2日，乙醇消毒两后腿足，上、下、左、右围置冰袋（3份冰+1份结晶氯化钙，粉碎混合，温度降至-20～-25 ℃冷冻1.5 h，45 ℃温水复温5 min（室温12 ℃），共冷冻1次。冷冻后14 d，家兔表现为精神萎糜不振，两后肢匍伏跛行，膝关节肿胀、周径明显大于对照组，局部青紫、皮温不高，表示成功建立RA寒证模型。
1.4 针刺方法
先将家兔固定，选取后腿“足三里”[13]。各针刺组分别施以相应针法。热补针法操作参照《郑氏针灸全集》[14]：左手拇指紧按穴位，右手持针刺入穴内8～12 mm，针刺得气后，左手加重压力，右手拇指向前连续捻按5次；针下沉紧后针尖拉着有感应的部位，连续重插轻提5次；拇指再向前连续捻按5次，反复操作1 min；最后使针下沉紧，留针30 min。平补平泻法、捻转补法操作参照《刺法灸法学》[15]。平补平泻法：针刺得气后，前后均匀捻转，不单向捻转，指力均匀，角度180?～360?，频率60～90 r/min，反复操作1 min。捻转补法：针刺得气后，小幅度前后捻转针体（角度180?～360?，频率60～90 r/min），拇指向前左转时用力重、指力沉重向下，拇指向后右转还原时用力轻，反复操作1 min。每日1次，每次留针30 min，连续7 d。
1.5 样本采集
针刺结束后，收集各组新鲜尿液，8000 r/min离心10 min，用EP管收集上层尿液，离心分装后置于-80 ℃冰箱保存备用。
1.6 样品衍生化处理
尿液常温解冻后，混匀，取200 μL，12 000 r/min离心10 min，取上清液50 μL，加尿素酶10 μL，混匀，37 ℃反应15 min；加200 μL甲醇，转入进样瓶，置温和氮气下吹干；加入30 μL甲氧胺盐酸吡啶 （20 mg/mL）溶液，强烈震荡30 s，37 ℃反应90 min；取出，加入30 μL BSTFA（含1%TMCS，BSTFA∶TMCS=99∶1）的衍生试剂，70 ℃反应60 min。取出样本，室温放置30 min备检。
1.7 气相色谱-质谱条件
进样口温度280 ℃，EI离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，高纯氦气（纯度>99.999%）作为载气，不分流进样，进样量1.0 μL。升温程序为：初始温度80 ℃，维持2 min，10 ℃/min速度升至320 ℃，维持6 min。采用全扫描模式进行质谱检测，质谱检测范围为50～550 m/z。采用随机顺序进行连续样本分析，避免仪器信号波动所造成的影响。
1.8 统计学方法
原始数据采用XCMS软件进行特征离子峰提取、峰对齐、色谱峰识别及峰匹配，然后构建多维数据集，采用SIMCA-P13.0进行多维数据分析，数据预处理采用Par的方式，数据分析方法包括主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），最后获得差异物质。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 原始色谱图的可视化检查
对所有样本的总离子流色谱图（TIC）进行重叠与匹配分析（见图1），结果表明，质谱峰形明显、界限清晰、重现性好，与标准品谱峰一致，5组样品质谱峰重叠性良好。
2.2 模式识别
各组PCA图见图2。为了最大化反映各组别间代谢模式的差异，采用监督性PLS-DA，见图3。从图3中可以看出各组明显区别，针刺干预后向正常组回归，并且热补针法组更突出。据PLS-DA模型第一主成分VIP值（阈值>1）并同时结合P值（P<0.05）来寻找差异性表达代谢物。通过以上分析，最终获得的生物标记物见表1。可以得出，模型组尿液代谢物变化较正常组主要体现为氨基酸代谢相关物质降低，三羧酸循环、糖类代谢、脂肪酸代谢增强。各针刺组较模型组主要体现为三羧酸循环代谢及脂肪酸代谢降低，且热补针法组三羧酸循环明显于低平补平泻组和捻转补法组。
3 讨论
RA属中医学“痹证”范畴。正气虚弱是RA发病的内因，风寒湿邪侵犯是外因，邪气乘虚侵入四肢关节筋骨，阳气虚不能驱邪外出，邪气黏滞缠绵，闭阻经络，发为此病。热补针法是郑魁山教授临床治疗RA的经验结晶，具有补益正气、温阳散寒的功用，与RA的病机特点相吻合。现代医学研究发现，RA的发生与三羧酸循环、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、葡萄糖代谢等密切相关[16-19]，其涉及的相关代谢物有柠檬酸、琥珀酸、肉碱、亮氨酸、麦芽糖、乳糖、嘧啶核苷酸、尿酸等。说明RA的发病机制具有途径广、层次多等复杂的网络系统特点。因此，从现代医学角度而言，其发病机制与针灸多靶点、多途径、多层次、类似于网络结构的作用特点相符。
本研究发现，模型组中琥珀酸、柠檬酸、异柠檬酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸、丙酮酸的量异常升高，以上这些物质均是三羧酸循环的中间产物。三羧酸循环反应在线粒体内发生，线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所，它为细胞的活动提供了能量，这些代谢物的排泄增加可能会引发能量的供应不足。有研究显示，RA关节腔缺氧[20]，细胞适应缺氧主要是从氧化磷酸化向糖酵解途径转换以产生ATP，模型组中乳糖参与糖代谢，是机体内的能量物质，其生成的半乳糖磷酸酯可以为糖酵解途径提供能量，尿液中乳糖排泄量的异常说明RA体内糖酵解途径发生改变而导致能量代谢通路出现紊乱。因此，我们的研究证实了这一结论。模型组中L-亮氨酸水平下降，它属于支链亮氨酸，对于促进肌肉蛋白质的合成、骨豁肌微细损伤的修复、糖异生以及骨豁肌葡萄糖的摄取都起着重要的作用[21]；模型组参与多不饱和脂肪酸代谢的2-羟基十六烷酸、前列腺素E2甲酯、癸二酸、壬二酸的水平异常增高，以上这些物质可促使炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-6的产生，TNF-α是RA发病机制中关键的促炎因子，可刺激软骨细胞合成IL-6与IL-8，产生进一步的炎性反应，与IL-6、IL-1β等协同共同促进破骨细胞的生成导致骨质的破坏[22]，TNF-α又可增加一氧化氮、前列腺素E的生成和骨的吸收[23]。综上所述，这些代谢途径的改变可以解释RA机体全身炎性反应状态导致对能量的需求增加及供给的相对不足，经针刺干预后，参与脂肪酸代谢的上述代谢物均显著降低（P<0.05），各针刺组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。针刺干预后参与三羧酸循环的上述物质普遍下调，尤以热补针法组琥珀酸、α-酮戊二酸、草酰乙酸下调最显著（P<0.05），说明热补针法可以调节RA异常的能量代谢通路。
平补平泻法、捻转补法及热补针法均可使RA异常的三羧酸循环、脂肪酸代谢发生逆转，提示这些针刺手法可调控RA体内三羧酸循环（能量代谢）、脂肪酸代谢（抗炎效应）通路，而热补针法在调控三羧酸循环方面均明显优于平补平泻、捻转补法。基于此，我们认为调控三羧酸循环（能量代谢）可能是热补针法治疗RA的特异性机制。
参考文献：
[1] ZHU J， CHEN X Y， LI L B， et al. Electroacupuncture attenuates collagen-induced arthritis in rats through vasoactive intestinal peptide signalling-dependent re-establishment of the regulatory T cell/T-helper 17 cell balance[J]. Acupuncture in Medicine，2015：acupmed-2014-010732.
[2] 李文迅，黄怡然，雷林丹，等.电针、手针“足三里”对慢性关节炎大鼠血清炎性细胞因子含量的影响[J].针刺研究，2012，37（4）：271-276.
[3] LI J， LI J， CHEN R， et al. Targeting NF-κΒ and TNF-α activation by electroacupuncture to suppress collagen-induced rheumatoid arthritis in model rats[J]. Altern Ther Health Med，2015，21（4）：26-34.
[4] OUYANG B S， GAO J， CHE J L， et al. Effect of electro- acupuncture on tumor necrosis factor-alpha and vascular endothelial growth factor in peripheral blood and joint synovia of patients with rheumatoid arthritis[J]. Chin J Integr Med，2011，17（7）：505-509.
[5] 张星华，朱博雯，杨晨光，等.热补针法治疗风寒湿阻型风湿性关节炎的临床疗效[J].辽宁中医杂志，2015，42（5）：1076-1078.
[6] 杜小正，方晓丽，东贵荣.热补针法对关节炎兔的镇痛后效应及其脑脊液中β-EP和CCK-8含量的影响[J].中医研究，2011，24（6）：18-20.
[7] 杜小正，秦晓光，方晓丽.热补针法镇痛后效应的观察及其对外周PGE-2，SP含量变化的影响[J].中医研究，2010，23（1）：18-21.
[8] 杜小正，秦晓光，方晓丽.热补针法镇痛后效应及其对关节局部组织β-内啡肽和前列腺素E2的影响[J].针刺研究，2009，34（5）：319-323.
[9] HORNING E C， HORNING M G. Metabolic prfiles：gas-phase methods for analysis of metabolites[J]. Clin Chem，1971，17（8）：802-809.
[10] KANG J， ZHU L， LU J， et al. Application of metabolomics in autoimmune diseases：Insight into biomarkers and pathology[J]. J Neuroimmunol，2015，279：25-32.
[11] TOMINGA K， ALSTERGREN P， KURITA H， et al. Clinical course of an antigen-induced arthritis model in the rabbit temporomandibular joint[J]. J Oral Pathol Med，1999，28（6）：268- 273.
[12] 吴垦莉，张珊珊.寒凝血瘀证动物模型的研制[J].中国中医基础医学杂志，1996，2（2）：49-51.
[13] 李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2007：242-247.
[14] 郑魁山，郑俊江，郑俊鹏，等.郑氏针灸全集[M].北京：人民卫生出版社，2000：289-290.
[15] 陆寿康.刺法灸法学[M].北京：中国中医药出版社，2003：92-95.
[16] YUE R， ZHAO L， HU Y， et al. Metabolomic study of collagen- induced arthritis in rats and the interventional effects of Huang-Lian-Jie-Du-Tang， a traditional Chinese medicine[J]. J Ethnopharmacol，2013，145（2）：465-475.
[17] YANG X Y， DI Z K， LIN K， et al. Energy metabolism disorder as a contributing factor of rheumatoid arthritis：acomparative proteomic and metabolomic study[J]. PLoS one，2015，10（7）：e0132695.
[18] SPIES C M， STRAUB R H， BUTTGEREIT F. Energy metabolism and rheumatic diseases：from cell to organism [J]. Arthritis Res Ther，2012，14（3）：216-226.
[19] CHIMENTI M S， TUCCI P， CANDI E， et al. Metabolic profiling of human CD4+ cells following treatment with methotrexate and anti-TNF-α infliximab[J]. Cell Cycle，2013，12（18）：3025-3036.
[20] SIVAKUMAR B， AKHAVANI M A， WINLOVE C P， et al. Synovial hypoxia as a cause of tendon rupture in rheumatoid arthritis[J]. J Hand Surg Am，2008，33（1）：49-58.
[21] 张庆，漆正堂，丁树哲.亮氨酸及其代谢产物促进蛋白质合成的分子机制及其补充效果[J].生命的化学，2009，29（1）：103-107.
[22] SCOTT D L， WOLFE F， HUIZINGA T W. Rheumatoid arthritis[J]. Lancet，2010，376（9746）：1094-1108.
[23] RALSTON S H， GRABOWSKI P S. Mechanisms of cytokine induced bone resorption：role of nitric oxide， cyclic guanosine monophosphate， and prostaglandins[J]. Bone，1996，19（1）：29-33.
（收稿日期：2016-01-23）
（修回日期：2016-02-20；编辑：华强）
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更新时间：2025/3/22 5:24:54