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标题 基于多指标分析甘肃产掌叶大黄质量
范文 陆国弟 李成义 王惠珍 杨扶德 王明伟 沈俊忠



摘要：目的 采用指紋图谱与一测多评相结合的方法测定掌叶大黄5种指标性成分，分析比较甘肃不同产区、不同生长年限掌叶大黄质量，确定其最适种植区和最佳发展区。方法 采用药典方法测定掌叶大黄含水量、总灰分、水溶性浸出物，HPLC测定5种指标性成分，指纹图谱与一测多评相结合评价15批掌叶大黄质量。结果 15批掌叶大黄的含水量均小于15%，总灰分均小于10%，水溶性浸出物均大于25%，符合药典标准；15批样品指纹图谱标定共有峰23个，其中已确定成分芦荟大黄素线性范围0.012 2～0.734 4 ?g（r=0.999 9）、大黄酸线性范围0.007 14～5.712 0 ?g（r=0.999 9）、大黄素线性范围0.008 8～0.704 0 ?g（r=1.000 0）、大黄酚线性范围0.122 4～3.672 0 ?g（r=0.999 9）、大黄素甲醚线性范围0.014 8～5.920 0 ?g（r=0.999 7）；采用相对校正因子计算的含量值与实测值之间无显著差异，建立的相对校正因子重现性良好。甘肃产掌叶大黄质量在不同产区、不同年限间存在显著差异（P<0.05），其中礼县上萍乡、宕昌南河乡茹树村所产2年生掌叶大黄质量最好，宕昌地区掌叶大黄3年生优于2年生。结论 所建立的指纹图谱和一测多评方法准确、可行，可用于甘肃掌叶大黄质量比较。各产区中，以礼县和宕昌地区适宜种植及发展大黄产业，甘肃礼县和宕昌地区2年生以上掌叶大黄适合药用。
关键词：掌叶大黄；指纹图谱；一测多评法；质量比较
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.014
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）10-0057-07
Analysis on Quality of Rheum Palmatum L. from Gansu Province Based on Multicriteria Method LU Guo-di1， LI Cheng-yi1， WANG Hui-zhen1， YANG Fu-de1， WANG Ming-wei1， SHEN Jun-zhong2 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Tanchang Science and Technology Bureau， Longnan 748500， China）
Abstract： Objective To compare the quality of Rheum palmatum L. in different areas and ages in Gansu Province by comparing five components in Rheum palmatum L. through fingerprints and QAMS （quantitative analysis of multi-components） methods； To determine the most suitable growing areas and the best development areas in Gansu Province. Methods The water content， total ashes， and water-soluble extract content in 15 batches of Rheum palmatum L. from different areas and ages in Gansu Province were determined according to the approaches listed in the Chinese Pharmacopeia. The contents of five index components were determined through HPLC and the quality of 15 batches of Rheum palmatum L were evaluated by fingerprint and QAMS method. Results The results from 15 batches of Rheum palmatum L. showed that the water content was less than 15%， total ashes less than 10%， and water-soluble extract content less than 25%， conforming to Pharmacopoeia. There were 23 common peaks in the fingerprints of 15 batches of Rheum palmatum L.. Five of them were identified as aloe-emodin， rhein， emodin， chrysophanol and physcion， which showed good linear relationship in the range of 0.012 2–0.734 4 ?g （r=0.999 9）， 0.007 14–5.712 0 ?g （r=0.999 9）， 0.008 8–0.704 0 ?g （r=1.000 0）， 0.122 4–3.672 0 ?g （r=0.999 9） and 0.014 8– 5.920 0 ?g （r=0.999 7）， respectively. There was no significant difference between the calculated value and the measured value by using the relative correction factor （RCF）， and the reproducibility of RCF was good. The quality of
基金项目：甘肃中医药大学中青年科研基金项目（2305016601）
通讯作者：王惠珍，E-mail：whz1974828@163.com
Rheum palmatum L. from different areas and ages in Gansu Province significantly differed （P<0.05）. Two year old Rheum palmatum L. from Pingxiang village of Li county and Rushu village of Tanchang county had the best quality， and that of three years old was better than two years old from Tanchang county. Conclusion The established fingerprints and QAMS method is accurate， feasible， and can be used for the quality comparison of Rheum palmatum L. from different areas and ages in Gansu Province. Li County and Tanchang County areas in Gansu Province can be used as suitable planting areas and development industry. Therefore， it is recommended to select more than two yeas old Rheum palmatum L. from Tanchang County and Li County in Gansu Province for medicinal application.
Key words： Rheum palmatum L.； fingerprints； QAMS； qualitative comparison
掌叶大黄Rheum palmatum L.为蓼科大黄属植物，药用其干燥根和根茎，含有多种化合物，包括蒽醌类、鞣质类、二苯乙烯类、苯丁酮类等，其中蒽醌类成分是大黄的主要化学成分和生理活性物质[1-2]，主要包括芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚5种，2015年版《中华人民共和国药典》对大黄药材的质量控制主要是这5种成分的总含量[3]。
掌叶大黄主产于甘肃，种植范围较广，但在经济利益驱使下，各地忽略中药材适宜种植区，盲目扩种和引种，随意跨范围种植，导致品质大打折扣，流通商品质量参差不齐[4-5]。因此，本研究从甘肃不同产区采集15批掌叶大黄新鲜药材，统一干燥处理，利用指纹图谱和一测多评相结合[6]的方法，快速、全面分析比较其质量，从而确定甘肃掌叶大黄最适种植区和最佳发展区。
1 仪器与试药
Agilent1200高效液相色谱系统（路易公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD二极管阵列检测器），Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，包括四元梯度泵、在线真空脱气机、自动进样系统、G1316A柱温箱、G1315B二极管阵列检测器），Agilent1260高效液相色谱系统（美国安捷伦公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD二极管阵列检测器），色谱柱Agilent HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）、Agilent Eclipse XDB-C18（250mm×4.6mm，5 ?m），XS205DU型梅特勒-托利多分析天平（梅特勒-托利多上海有限公司），BK8200HP型超声波清洗仪（上海科导超声仪器公司），Dragon-lab移液枪（B120048）。
对照品芦荟大黄素（批号06714，质量分数98%）、大黄酸（批号04X13，质量分数98%）、大黄素（批号09H13，质量分数98%）、大黄酚（批号04714，质量分数98%）、大黄素甲醚（批号04714，质量分数90%），西玛试剂有限公司。甲醇为色谱纯，纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。
采集甘肃不同产区同年2年生或3年生新鲜掌叶大黄，经甘肃中医药大学杨扶德教授鉴定为掌叶大黄Rheum palmatum L.的根和根茎，统一进行干燥，见表1。
2 方法与结果
2.1 水分测定
按2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则0832项下烘干法进行测定，结果见表2。15批大黄供试品水分含量均小于15.0%，符合药典标准。
2.2 总灰分测定
按2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则2302项下总灰分测定法进行测定，结果见表2。15批大黄供试品总灰分均未超过10.0%，符合药典标准。
2.3 浸出物测定
参照2015年版《中华人民共和国药典》（四部）通则2201项下水溶性浸出物测定法项下热浸法进行测定，结果见表2。15批大黃供试品水溶性浸出物含量均大于25.0%，符合药典标准。
2.4 指纹图谱建立
2.4.1 色谱条件 采用Agilent HC-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）色谱柱，流动相为甲醇（A）-0.1%磷酸水（B），线性梯度洗脱（0～15 min，40%A，60%B；15～30 min，50%A，50%B；30～50 min，60%A，40%B；50～80 min，80%A，20%B；80～95 min，100%A），流速1 mL/min，柱温30 ℃，检测波长254 nm，进样量10 ?L。
2.4.2 混合对照品溶液制备 精密称取对照品大黄素甲醚7.40 mg、大黄酚6.12 mg、大黄素0.88 mg、大黄酸7.14 mg、芦荟大黄素1.53 mg，分别置5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分别配成5个对照品贮备液。分别精密量取大黄素甲醚、大黄酚、大黄素、大黄酸贮备液1 mL，芦荟大黄素贮备液0.8 mL，置5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配成高浓度混合对照品溶液，再精密吸取1 mL高浓度混合对照品溶液，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，配成低浓度混合对照品溶液，将上述对照品贮备液、混合对照品溶液于4 ℃保存，备用。
2.4.3 供试品溶液制备 取样品粉末（过4号筛）约0.40 g，精密称定，置50 mL圆底烧瓶中，加入85%甲醇25 mL，回流提取30 min，过滤，取续滤液，用0.45 ?m滤膜过滤，即得。
2.4.4 精密度试验 取11号样品，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下连续进样5次，测定其指纹图谱，记录芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积积分值，计算RSD，结果分别为0.22%、0.10%、0.25%、0.17%、0.30%。采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》计算指纹图谱相似度，结果均相似度≥0.998，表明仪器精密度良好。
2.4.5 重复性试验 精密称取11号样品粉末（过4号筛）各约0.4 g，按“2.4.3”项下方法制备6份供试品溶液，分别精密吸取10 ?L进样测定，计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种成分峰面积积分值的RSD，结果分别为2.16%、0.84%、2.24%、1.72%、2.31%，指纹图谱均相似度≥0.995。表明样品处理方法的重复性较好。
2.4.6 稳定性试验 精密吸取11号供试品溶液10 ?L，分别于制备后的0、3、5、8、12 h进样测定，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种成分峰面积积分值的RSD分别为2.02%、0.77%、2.12%、1.64%、2.20%，指纹图谱均相似度>0.995，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.4.7 共有模式建立及部分共有峰指认 分别精密吸取1～15号供试品溶液10 ?L进样测定，并将其指纹图谱以AIA格式依次导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》，以11号样品指纹图谱作为参照谱，使用中位数进行自动匹配，加以多点校正，生成指纹图谱共有模式，标定共有峰23个（见图1）。精密吸取混合对照品溶液10 ?L进样测定，通过与对照品保留时间及紫外吸收光谱图比对，指认指纹图谱23个共有峰中的5种成分，分别为芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚，色谱图见图2。
2.4.8 指纹图谱相似度评价 以共有模式作为对照指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》对1～15号样品指纹图谱进行相似度评价，结果1～15号样品相似度良好，分别为0.927、0.926、0.959、0.961、0.929、0.864、0.906、0.955、0.926、0.973、0.883、0.847、0.827、0.879、0.916。
2.5 一测多评法测定5种成分含量
2.5.1 線性关系考察 分别精密吸取低浓度和高浓度混合对照品溶液1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 ?L，按“2.4.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，以峰面积对进样量（?g）进行回归处理，得5种成分回归方程及线性范围。结果表明，各成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系，见表3。
2.5.2 加样回收率试验 精密称取11号样品粉末（过4号筛）3份，各约0.2 g，置50 mL圆底烧瓶中，分别精密添加一定体积5种对照品贮备液，补充加入85%甲醇至25 mL，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，测定并计算各成分加样回收率及RSD，结果见表4。5种成分回收率在95%～100%之间，表明本方法回收率良好。
2.5.3 相对校正因子的计算 取高浓度混合对照品溶液，进样1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 ?L测定，以大黄素为内标，根据公式计算相对校正因子。fs/i=fs/fi=（Ws×Ai）/（Wi×As），其中As为内参物峰面积，Ws为内参物质量，Ai为待测成分对照品i峰面积，Wi为待测成分对照品i质量。依据以上公式计算芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚的相对校正因子，结果见表5。
2.5.4 相对校正因子重现性考察 精密吸取混合对照品溶液10 ?L，进样分析，考察不同实验室、不同液相、不同色谱柱、不同流速、不同柱温对相对校正因子的影响，结果RSD均小于2.00%，见表6。表明在不同色谱系统、不同色谱柱及不同流速、不同柱温条件下具有良好的重现性。
2.5.5 待测组分色谱峰定位 通过计算在不同色谱仪器或不同色谱柱中各待测成分色谱峰与大黄素色谱峰的相对保留时间或保留时间差，对各待测成分进行定位。结果表明各待测成分相对保留值RSD均小于3.04%，可以用于待测成分色谱峰的定位，结果见表7。
2.5.6 一测多评法与外标法测定结果比较 分别精密吸取1～15号供试品溶液10 ?L，注入高效液相色谱仪测定。采用外标法测定掌叶大黄中芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种成分含量，再用建立的一测多评法进行含量计算，结果见表8、表9。用QAMS法及外标法所测得的掌叶大黄中5种成分的含量基本一致，表明QAMS法在掌叶大黄多指标成分质量评价中应用是可行的。
3 讨论
本试验考察了提取溶剂甲醇浓度（50%、85%和100%）对掌叶大黄5种指标性成分提取率的影响，结果表明，85%甲醇提取率最高，峰形较好且分离度好，杂质较少。考察超声（30、60 min）和回流（30、60 min）2种提取法对5种待测成分提取率的影响，结果表明，2种方法提取30 min即可提取完全，但回流提取率较超声高，故提取方法最终确定为回流提取30 min。此外，本试验还考察不同色谱柱、不同色谱仪对相对校正因子及相对保留时间的影响，并以RSD作为指标，结果表明，在上述条件下，相对校正因子及相对保留时间重现性良好。
本试验采集甘肃不同产区15批掌叶大黄进行指纹图谱标定，发现15批掌叶大黄相似度在0.827以上，表明其相似度良好，说明15批样品采集区均可作为甘肃掌叶大黄的种植产区。
本试验对不同产区2年生掌叶大黄进行含量测定，结果表明，甘肃所产掌叶大黄中以陇南产区（礼县、宕昌县）质量最优。其中礼县上萍乡、宕昌县南河乡茹树村所产掌叶大黄质量最好，其指标性成分含量显著高于其他产区（P<0.05）；岷县种植基地、和政县、宕昌县狮子乡为石村质量最差，其含量显著低于其他产区（P<0.05）。并由表8可知，影响大黄质量最大的成分是大黄素甲醚。但各产地掌叶大黄中5种成分的含量与总成分含量呈现的趋势并不一致，规律性不强。此外，宕昌县南河乡茹树村、阿乌乡哈达村及好梯乡彭家山村所产掌叶大黄质量优于礼县铨水乡、草坪乡（P<0.05）。可考虑把宕昌县南河乡茹树村、阿乌乡哈达村及好梯乡彭家山村作为甘肃掌叶大黄规模化发展的补充性产区。
本试验对宕昌县3个种植区3年生掌叶大黄进行含量测定，结果表明，好梯乡彭家山村所产大黄质量最好，其含量显著高于狮子乡为石村、竹园乡大草坡村（P<0.05），竹园乡大草坡村所产大黄质量最差，其含量显著低于其他产区（P<0.05）。由表1推测可知，宕昌县种植大黄的适宜海拔高度为2000～2300 m，超过2400 m或低于2000 m，都会使大黄药材质量下降，因为海拔越高，气温越低，大黄比低海拔区域生长缓慢，故同一生长年限其质量下降；而海拔低于2000 m，气温高，降水量少，也会影响其质量。同时与产区土壤有关，狮子乡和竹园乡位于宕昌县东南部，地形主要是深山峡谷，土壤石化严重，故会影响大黄质量。
对宕昌县4个种植区2年生掌叶大黄和3个种植区3年生掌叶大黄样品指标性成分含量分析发现，3年生优于2年生，但目前市场上供应的大黄药材大多为2年生，为提高藥材质量，建议甘肃规范化种植大黄将种植年限延长到3年。
综上所述，本试验所建立的指纹图谱和一测多评方法准确、可行，可用于甘肃不同产区、不同年限掌叶大黄质量比较。同时，含量测定结果表明，甘肃所产掌叶大黄质量优良，3年生优于2年生，各产区中尤以礼县和宕昌县适宜种植大黄和发展大黄产业，但建议宕昌县狮子乡为石村和竹园乡大草坡村应加强栽培、管理技术，从而确保掌叶大黄质量。
参考文献：
[1] 高晓燕，卢建秋.HPLC-DAD法同时测定大黄中7个蒽醌类化合物的含量[J].药物分析杂志，2010，30（9）：1636-1641.
[2] 闵云山，焦正花，张小华，等.RP-HPLC测定止痛膏中大黄酸、大黄素和大黄酚的含量[J].中国中医药信息杂志，2012，19（7）：52-53.
[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：23.
[4] 逄瑜，孙磊，金红宇，等.指纹图谱结合化学计量学分析用于多种大黄的鉴别及质量评价[J].中国药学杂志，2014，49（4）：287-293.
[5] 任伟光，王琦，黄林芳.大黄类药材的质量评价进展[J].中南药学， 2014，12（4）：354-359.
[6] 窦志华，乔进，卞理，等.指纹图谱与一测多评法相结合的大黄质量控制方法[J].中国药学杂志，2015，50（5）：442-448.
（收稿日期：2016-11-14）
（修回日期：2016-12-08；编辑：陈静）
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