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标题 HPLC同时测定参积护胃颗粒中积雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d含量
范文 姜正华 李劲平 石丽颖 谢保平


摘要：目的 建立参积护胃颗粒中积雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d含量测定的HPLC分析方法。方法 采用广州研创C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-磷酸盐缓冲液（含磷酸二氢钾8.34‰、磷酸氢二钾0.87‰），梯度洗脱（0～15 min，20%A；15～30 min，20%→40%A；30～42 min，40%A；42～45 min，40%→48%A；45～50 min，48%A；50～70 min，48%→50%A），流速1.0 mL/min，检测波长210 nm，柱温30 ℃。结果 积雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d分别在0.173～2.770 μg（r=0.999 9）、0.021～1.320 μg（r=0.999 2）、0.151～9.660 μg（r=0.999 3）范围内呈良好线性关系。积雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d平均加样回收率分别为96.25%、97.02%、97.84%，RSD分别为2.31%、4.51%、1.87%。结论 该含量测定方法简便、分离效果好、专属性强，能同时测定参积护胃颗粒中积雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d的含量，为参积护胃颗粒质量标准的完善提供依据。
关键词：参积护胃颗粒；积雪草苷；延胡索乙素；柴胡皂苷d；高效液相色谱法；质量控制
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.015
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）10-0064-04
Simultaneous Determination of Contents of Asiaticoside， Tetrahydropulmatine and Saikosaponin d in Shenji Huwei Granules by HPLC JIANG Zheng-hua， LI Jin-ping， SHI Li-ying， XIE Bao-ping （Xiangya School of Pharmaceutical Science， Central South University， Changsha 410013， China）
Abstract： Objective To develop an HPLC method for simultaneous determination of contents of asiaticoside， tetrahydropulmatine and saikosaponin d in Shenji Huwei Granules. Methods The analysis was performed on a R&C; C18 column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） by using the mobile phase of acetonitrile （A） - phosphate buffer （which used potassium dihydrogen phosphate 8.34 g， potassium phosphate 0.87 g dissolved by 1000 mL water） with gradient elution （0–15 min， 20%A； 15–30 min， 20%→40%A； 30–42 min， 40%A； 42–45 min， 40%→48%A； 45–50 min， 48%A； 50–70 min， 48%→50%A）. The flow rate was 1.0 mL/min； the detection wavelength was set at 210 nm； the column temperature was maintained at 30 ℃. Results Asiaticoside， tetrahydropulmatine and saikosaponin d were in the linear ranges among 0.173–2.770 μg （r=0.999 9）， 0.021–1.320 μg （r=0.999 2）， 0.151–9.660 μg （r=0.999 3）， respectively. The average recovery rates of asiaticoside， tetrahydropulmatine， saikosaponin d were 96.25%， 97.02%， and 97.84%， respectively， and RSD were 2.31%， 4.51%， 1.87%， respectively. Conclusion This method is simple， with good separation effect and strong specificity， and can be used for simultaneous determination of contents of asiaticoside， tetrahydropulmatine and saikosaponin d in Shenji Huwei Granules， which provides references for perfection of quality control of Shenji Huwei Granules.
Key words： Shenji Huwei Granules； asiaticoside； tetrahydropulmatine； saikosaponin d； HPLC； quality control
參积护胃颗粒是由湖南中医药大学第一附属医院莫新民教授的临床经验方研制而成的颗粒剂，由党参、延胡索、柴胡等8味药组成，具有健脾疏肝、活
基金项目：湖南省科技计划（2009SK3190）
通讯作者：李劲平，E-mail：pjingli@163.com
血止痛功效，主要治疗胃溃疡、慢性胃炎等消化系统疾病。本课题组前期研究显示，参积护胃颗粒具有抗实验性胃溃疡的作用[1]。现代药理研究表明，党参中的党参炔苷及党参提取物对胃黏膜损伤有保护作用[2]；柴胡中的柴胡总皂苷对无水乙醇致大鼠胃黏膜损伤具有明显的抑制作用[3-5]，两者为方中君药。延胡索具有很好的活血行气痛作用，其中以延胡索乙素作用最强[6]，积雪草中的积雪草总苷对乙酸致慢性胃溃疡有明显抑制作用[7]。柴胡皂苷a和d、积雪草苷、延胡索乙素分别是2015年版《中华人民共和国药典》规定的柴胡、积雪草、延胡索质量控制的特征指标，故选取党参炔苷、柴胡皂苷a和d、积雪草苷及延胡索乙素作为指标成分进行含量测定，但在专属性试验中发现党参炔苷、柴胡皂苷a阴性样品有干扰，通过色谱条件和样品处理方法的优化也未能解决，所以最终选择测定积雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d的含量。為此，本试验建立同时测定参积护胃颗粒中积雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d含量的HPLC方法，为其质量标准的拟定提供依据。
1 仪器与试药
SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸易有限公司），R-1001N型旋转蒸发仪（郑州长城科工贸易有限公司），岛津AUW22OD型分析天平（日本岛津公司），DV215CD型电子天平（美国奥豪斯公司），YLD-2000型真空干燥箱（郑州长城科工贸易有限公司），岛津LC-2010AHT型高效液相色谱仪（日本SHIMADZU公司），KQ5200型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），ZD-2型酸度计（上海大中分析仪器厂）。
延胡索乙素对照品（成都曼斯特生物科技公司，批号16032710，纯度99.86%），积雪草苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号110726-201604，纯度99.42%），柴胡皂苷d对照品（成都曼斯特生物科技公司，批号16060106，纯度98.55%），参积护胃颗粒（湖南中医药大学第一附属医院，批号20160602、20160915、20161216），乙腈、甲醇为色谱纯（ACS），其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液制备
精密称取积雪草苷对照品2.77 mg、延胡索乙素对照品1.32 mg、柴胡皂苷d对照品9.66 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，制成混合对照品溶液，备用。
2.2 供试品溶液制备
精密称取参积护胃颗粒5.00 g，置250 mL锥形瓶中，精密加入75%甲醇125 mL，超声提取（功率280 W，频率40 kHz）30 min，过滤，滤液减压浓缩蒸干，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，摇匀，备用。
2.3 阴性对照溶液制备
分别按供试品溶液制备方法制备缺积雪草、延胡索、柴胡的阴性对照溶液。
2.4 色谱条件
采用广州研创C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-磷酸盐缓冲液（含磷酸二氢钾8.34‰、磷酸氢二钾0.87‰），梯度洗脱（0～15 min，20%A；15～30 min，20%→40%A；30～42 min，40%A；42～45 min，40%→48%A；45～50 min，48%A；50～70 min，48%→50%A），流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 ?L。
2.5 专属性试验
分别取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，在上述色谱条件下进行HPLC分析，确定积雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d的峰位置，考察其他药材是否有干扰，色谱图见图1。可见，在该色谱条件下，HPLC测定积雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d具有较高的专属性，阴性样品无干扰。
2.6 线性关系和定量限考察
依次分别精密量取混合对照品溶液适量，置于5 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，连同母液，分别得到含积雪草苷277.00、138.50、69.25、34.63、27.70、17.32 μg/mL，延胡索乙素132.00、66.00、33.00、16.50、13.2、8.25 μg/mL，柴胡皂苷d 966.00、483.00、241.50、120.75、96.60、60.38 μg/mL的对照品溶液，进样10 ?L，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程。积雪草苷：Y=773.82X-1689.6，r=0.999 9；延胡索乙素：Y=31 663X+99 300，r=0.999 2；柴胡皂苷d：Y=1451.9X+19 027，r=0.999 3。以信噪比S/N=3为最低检测限（LLOD），S/N=10为最低定量限（LLOQ）。结果表明，积雪草苷在0.173～2.770 μg、延胡索乙素在0.021～1.320 μg、柴胡皂苷d在0.151～9.660 μg范围内呈良好的线性关系，LLOD分别为0.026、0.003、0.045 μg，LLOQ分别为0.087、0.010、0.151 μg。
2.7 精密度试验
连续重复进样含积雪草苷、延胡索乙素和柴胡皂苷d的低、中、高浓度混合对照品溶液各5次，进样体积为10 ?L，每日测定1次，连续测定3 d，得峰面积，根据标准曲线计算各待测物含量的平均值及RSD。结果积雪草苷低、中、高浓度的日内精密度及日间精密度含量的RSD分别为1.13%、0.46%、1.03%和1.64%、2.04%、1.57%；延胡索乙素低、中、高浓度的日内精密度及日间精密度含量的RSD分别为0.49%、0.42%、0.60%和0.88%、0.86%、1.47%；柴胡皂苷d低、中、高浓度的日内精密度及日间精密度含量的RSD分别为0.04%、1.27%、2.10%和0.29%、2.64%、2.48%。
2.8 稳定性试验
取同一份供试品溶液，室温分别放置0、2、4、8、12、18、24 h，进样10 ?L，得峰面积，计算各待测物含量的平均值及RSD。结果积雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d含量的RSD分别为0.60%、1.03%、0.34%，表明供试品溶液中各待测物在24 h内基本稳定。
2.9 重复性试验
精密称取6份同一批号参积护胃颗粒样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样10 ?L，记录峰面积，计算得各待测物含量的平均值及RSD。结果积雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d含量分别为0.499、0.059、3.112 mg，RSD分别为1.87%、0.82%、0.42%，表明该方法重复性良好。
2.10 加样回收率试验
精密称取已测得含量（积雪草苷0.504 mg、延胡索乙素0.059 mg、柴胡皂苷d 3.109 mg）的参积护胃颗粒6份，每份1.00 g，分别精密加入适量积雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d对照品溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样10 ?L，记录峰面积，计算得各待测物平均回收率及RSD，结果见表1，表明该方法的准确度良好。
2.11 样品含量测定
精密称取3个批号的参积护胃颗粒样品，每批3份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样10 ?L，测定并记录峰面积，以标准曲线法分别计算样品中积雪草苷、延胡索乙素、柴胡皂苷d含量及RSD，结果见表2。
3 讨论
将积雪草苷、延胡素乙素和柴胡皂苷d的对照品溶液分别在200～400 nm波长范围内进行光谱扫描，结果积雪草苷和柴胡皂苷d在205、210 nm处有较大吸收，延胡索乙素在210、262、280 nm处有较大吸收，综合考虑，延胡索乙素在210 nm处也有很强的吸收，且含量较高，兼顾3个化合物的检测灵敏度和干扰情况，以及减少3个成分峰之间峰高的差别，选择210 nm为检测波长。
本试验分别考察了广州研创C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）、Agilent TC-C18（150 mm×4.6 mm，5 ?m）色谱柱，结果发现色谱柱为广州研创C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）时，延胡索乙素峰形对称且分离度良好；再通过对甲醇-水[8]、乙腈-水[9-12]、甲醇-磷酸溶液-三乙胺[13-15]、乙腈-醋酸溶液-三乙胺[16]、甲醇-磷酸鹽缓冲液[17]、乙腈-磷酸盐缓冲液不同比例和流速的考察，发现单独用甲醇-水、乙腈-水为流动相时延胡索乙素峰拖尾严重，而用甲醇-磷酸溶液-三乙胺、乙腈-醋酸溶液-三乙胺为流动相时积雪草苷、柴胡皂苷d在60 min内均未出峰。所以最后优选出色谱条件为广州研创C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流动相为乙腈-磷酸盐缓冲液（含磷酸二氢钾8.34‰，磷酸氢二钾0.87‰），梯度洗脱，流速1.0 mL/min，此时所测组分色谱峰得到良好分离，同时缩短了分析时间。
本研究采用单因素试验对供试品溶液制备中的提取溶剂、提取时间和溶剂用量进行了考察。分别考察了不同体积分数的甲醇、水、乙醇等溶剂的提取效果，结果采用75%甲醇为提取溶剂时各指标成分提取率均较高，且分离度更佳；对不同提取时间进行了考察，以75%甲醇为提取溶剂分别超声提取15、30、45 min，结果表明超声提取30 min与45 min的提取结果基本一致，表明超声提取30 min时基本提取完全；对提取溶剂用量为15、20、25、50倍（V/M）量时进行比较，结果表明使用25倍溶剂即可。最终得到最优化的提取方法为用25倍量75%甲醇超声提取30 min。
本试验建立了HPLC同时测定参积护胃颗粒中积雪草苷、延胡索乙素和柴胡皂苷d含量的方法，该方法简单快速，准确可靠，重复性好，且在各组分适宜波长处分别测定其含量，大大提高了检测灵敏度，可作为参积护胃颗粒多组分含量测定方法，为其质量控制和质量标准的建立提供了依据。
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（收稿日期：2017-03-14）
（修回日期：2017-04-19；编辑：陈静）
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更新时间：2025/3/10 17:28:05