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标题 HPLC同时测定唐古特大黄地上部分6种化学成分含量
范文 陈丽萍 李茂星 马幸福



摘要：目的 建立HPLC同时测定唐古特大黄地上部分中大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素、番泻苷A和番泻苷B共6种成分含量的方法。方法 采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流动相为甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0 min，70%B；5 min，65%B；8～16 min，60%B；18～23 min，55%B；25～30 min，45%B；32～39 min，35%B；49～57 min，24%B；65～72 min，20%B）；流速1.0 mL/min，检测波长254 nm，柱温为室温，按外标法定量分析。结果 大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、番泻苷A、番泻苷B在一定范围内与峰面积积分值线性关系良好（r≥0.999 5），方法的精密度RSD为0.75%～1.17%，重复性RSD為0.99%～2.06%，稳定性RSD为0.97～1.76%，平均加样回收率为99.7%～100.4%。唐古特大黄根和地上部分6种化学成分含量存在差异。结论 所建立的方法能同时测定唐古特大黄地上部分6种成分的含量，可作为大黄地上部分化学成分含量测定的参考方法。
关键词：唐古特大黄；大黄素；大黄酚；大黄素甲醚；芦荟大黄素；番泻苷A；番泻苷B；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.018
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）10-0076-05
Simultaneous Determination of Contents of 6 Components in Aerial Part of Rheum tanguticum Maxim.ex Balf by HPLC Method CHEN Li-ping， LI Mao-xing， MA Xing-fu （Department of Pharmacy， Lanzhou General Hospital of PLA， Key Laboratory of the Prevention and Cure for the Plateau Environment Damage， PLA， Lanzhou 730050， China）
Abstract： Objective To develop an HPLC method to determine the contents of chrysophanol， emodin， physcion， aloe-emodin， sennoside A， and sennoside B simultaneously in the aerial part of Rheum tanguticum Maxim.ex Balf. Methods The analysis was achieved with an Agilent ZORBAX SB-C18 analytic column （250 mm × 4.6 mm， 5 μm） by gradient elution of methanol-0.1% phosphoric acid in water gradient elution system （0 min， 70% B； 5 min， 65% B； 8–16 min， 60% B； 18–23 min， 55% B； 25–30 min， 45% B； 32–39 min， 35% B； 49–57 min， 24% B； 65–72 min， 20% B）. The flow rate was 1.0 mL/min； detection wavelength was 254 nm； the column temperature was room temperature； the quantification used external standard method. Results The peak areas and concentrations of chrysophanol， emodin， physcion， aloe-emodin， sennoside A， and sennoside B showed good linear relationship within a certain concentration range （r≥0.999 5）； the RSD of precision was 0.75%–1.17%； the RSD of repeatability was 0.99%–2.06%； the RSD of stability was 0.97%–1.76%； the average recoveries were 99.7%–100.4%. The results showed that there were differences in content between the root and aerial part of Rheum tanguticum Maxim.ex Balf. Conclusion HPLC method for simultaneous determination of contents of 6 contents of the aerial part of Rheum tanguticum Maxim.ex Balf can be used as the references for quality control.
Key words： Rheum tanguticum Maxim.ex Balf； chrysophanol； emodin； physcion； aloe-emodin； sennoside A； sennoside B； HPLC
大黄被《神农本草经》列为中品，以干燥根和根茎入药，《中华人民共和国药典》规定的原植物为蓼
基金项目：国家自然科学基金（30672643、30472186、30772773）；甘肃省自然科学基金（3ZS051-A25-078）
通讯作者：李茂星，E-mail：limaox2005@aliyun.com
科植物唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.、掌叶大黄Rheum palmatum L.或药用大黄Rheum officinale Baill.[1]，属多年生宿根草本植物。唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.又称“鸡爪大黄”，主产于甘肃、青海、西藏等海拔2500 m以上的高寒、高海拔地区[2]，在我国已有多年的栽培历史。据文献报道，3种正品大黄中，唐古特大黄的质量较优，在某些药理药效方面胜于掌叶大黄和药用大黄[3]。唐古特大黄具有泻热攻坚、化瘀行滞、清火解毒消肿功效和抗动脉粥样硬化作用[4]，药用历史悠久，临床疗效确切，是我国常用传统大宗中药材。
通常入药用唐古特大黄为生长周期3年或5年的根、根茎的切制或炮制品。每年6～7月为大黄叶茂期，这一时期地上部分枝叶繁盛，叶柄茎枝粗壮，但采收时常依据传统做法，将地上部分作为非药用部位摒弃不用。在甘肃甘南州大黄药材GAP种植基地，每年大黄叶盛期都要耗费大量人工对地上部分进行酌情摘减，以确保根茎部正常生长。大黄地上部分每年秋季自然枯萎，年年可采，资源丰富。如果能对其进一步综合开发利用，将产生很大的经济效益和社会效益。
为发掘新的药用部位，使资源可持续发展，本研究对唐古特大黄生长期地上部分的化学成分进行分析，对其主要有效成分进行动态观察，以期为扩大新药源、合理使用中药材资源提供新的思路和有力依据，为综合开发利用及深入研究奠定基础。
1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪，Waters 996紫外检测器，Waters 600泵；Mettler AE 240电子分析天平（瑞典），Sorvall Legend Micro 17型电动离心机（Thermo Fisher），KQ-100A型超声波清洗机（上海科导超声仪器有限公司）。
番泻苷A对照品（批号YJ-C3-WG1160324）、番泻苷B对照品（批号YJ-C3-WG1160324），江苏永健医药科技有限公司，纯度均大于98%；芦荟大黄素对照品（批号795-201503）、大黃素对照品（批号756-201509）、大黄酚对照品（批号895-201526）、大黄素甲醚对照品（批号758-201506），中国食品药品检定研究院，纯度均大于98%。甲醇（色谱纯），SPECTRUM CHEMICAL MFG. CORP；甲醇（分析纯），立安隆博华（天津）医药化学有限公司；磷酸（分析纯），天津科密欧化学试剂公司；灭菌注射用水（四川科伦药业股份有限公司）；自制超纯水，其他试剂均为分析纯。
甘肃省甘南州玛曲县中药材GAP示范园区种植的3年生唐古特大黄种株，分别于2016年6月3日、7月5日采收地上部分，并按不同部位分解后，置于通风干燥处阴干，备用。所采药材均由兰州军区兰州总医院药材科李茂星博士鉴定为唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.。样品信息见表1。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流动相A为甲醇，B为0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱（0 min，70%B；5 min，65%B；8～16 min，60%B；18～23 min，55%B；25～30 min，45%B，32～39 min，35%B，49～57 min，24%B，65～72 min，20%B）；柱温为室温；流速为1.0 mL/min；检测波长254 nm；进样量10 ?L；分析时间72 min。在此色谱条件下，指标性成分可与其他组分达到基线分离，且峰形良好。色谱图见图1。
2.2 对照品溶液制备
精密称取番泻苷A 0.002 1 g、番泻苷B 0.002 6 g、芦荟大黄素0.001 7 g、大黄素0.001 8 g、大黄酚0.001 1 g、大黄素甲醚0.002 9 g，分别用甲醇定容于10 mL容量瓶中，配制成质量浓度为0.21、0.26、0.17、0.18、0.11、0.29 mg/mL的对照品溶液。取上述对照品溶液各1 mL，加入10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得含番泻苷A 0.021 mg/mL、番泻苷B 0.026 mg/mL、芦荟大黄素0.017 mg/mL、大黄素0.018 mg/mL、大黄酚0.011 mg/mL、大黄素甲醚0.029 mg/mL的混合对照品溶液，4 ℃冰箱保存，备用。
2.3 供试品溶液制备
将低温烘干至恒重的样品粉碎后过40目筛。取本品粉末约1 g，精密称定后，置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，称定质量，超声（250 W，80 kHz）提取30 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 ?m微孔滤膜过滤，将续滤液转移至50 mL容量瓶中，70%甲醇定容，4 ℃冰箱保存备用。
2.4 线性关系考察
分别精密吸取混合对照品溶液2、4、8、16、32 ?L，按“2.1”项下色谱条件自动进样测定，记录色谱图，以对照品进样量（?g）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性回归，得回归方程，见表2。
2.5 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液，连续进样6次，每次进样10 ?L，测定番泻苷A、番泻苷B、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积积分值，计算其RSD，结果分别为1.13%、0.75%、0.98%、1.16%、1.17%、1.06%，表明仪器的精密度良好。
2.6 稳定性试验
取同一供试品溶液，分别在制备后0、2、6、8、12、24 h进样分析，每次进样10 ?L，记录峰面积积分值，计算番泻苷A、番泻苷B、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积RSD，结果分别为0.98%、1.02%、1.06%、0.97%、1.76%、1.05%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.7 重复性试验
取样品粉末约1 g，共6份，分别精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算番泻苷A、番泻苷B、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积RSD，结果分别为1.15%、0.99%、1.05%、2.06%、1.03%、1.17%，表明本法重复性良好。
2.8 加样回收率试验
取已知含量的样品粉末6份，每份0.25 g，分别精密加入混合对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样10 ?L，测定番泻苷A、番泻苷B、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚含量，计算加样回收率，结果见表3。
3 讨论
本课题组通过实地考察甘肃甘南州大黄GAP基地，以及对大黄各部分化学成分予以试验分析后发现，5-7月份是大黄生长期，尤以6月份长势明显，此时枝叶繁茂，叶茎、花茎粗壮，地上各部分的有效成分含量均较高；7月份以后，地上茎逐渐木质化，叶发黄、渐枯萎，化学成分含量有较大幅度降低。提示大黄地上部分的最佳采收期是叶茂期（6月），这一时间与中医学传统上关于叶类药材采收期的界定相一致。
大黄传统上以根和根茎入药。本课题研究发现，大黄地上部分含有与根及根茎类似的药用成分，如游离蒽醌和二蒽酮类。叶茎和花茎中游离蒽醌种类和含量均较根茎低，但二蒽酮类成分在唐古特大黄中各部位含量均较高，尤以叶片和花序中番泻苷A、B含量为高。国外药典中，常把是否含有番泻苷作为正品大黄的检测标准之一[5]。我国也有文献报道，唐古特大黄是药典规定大黄药材来源中品质较优的一种[3]。番泻苷A、B等二蒽酮类是大黄泻下活性的主要药效成分，具有清热行滞利水、排毒养颜的功效，并有一定抗菌活性[6]，可广泛用于药品和保健品。现已有许多学者对大黄中二蒽酮类成分予以关注并进行了相关研究报道[7-8]。因此，可以考虑对大黄地上部分中的番泻苷进行富集提取，有效利用大黄地上部分资源，既可扩大药源，又能提高药用植物资源利用率。
公元8世纪，著名藏医学家宇妥·元丹贡布《四部医典》有记载，我国西藏、青海、甘肃等地的群众，不仅以大黄的根部作药材，也使用大黄属植物地上部位的叶柄和幼嫩莖枝解渴、除翳。延续至今，我国南方和甘肃甘南的局部地区农牧民仍有食用唐古特大黄新鲜叶茎、花茎的习惯，因其肉厚多汁、口感较佳，深受当地居民的喜爱[9]。本课题组于2016年6月赴甘肃省甘南州玛曲县采集药材的过程中发现，大黄叶茎和花茎粗壮，且肉厚多汁，味酸爽，口感较佳。当地农牧民常剥去外皮生吃或作为蔬菜食用，这也进一步确证了《四部医典》和《妙音本草》中有关食用大黄属植物地上部位的叶柄和嫩枝的记载。大黄叶柄在国外常被用作食品调味剂等，通常被制成果酱、馅饼、饮料、酒品等，美国、英国等国家也已把大黄作为药食两用的基材[10]。随着大黄研究的不断深入和野生资源的相对匮乏，进一步开发大黄的多种药用部位已迫在眉睫。本研究初步建立了同时测定大黄地上各部分中6种化学成分含量的方法，为开发利用大黄地上植物资源提供了一定方法，也为民间食用大黄地上茎枝提供了依据。
大黄叶、叶茎、花茎、花序以及根和根茎中都含有蒽醌、二蒽酮、有机酸和钙、铁、锌等各种微量元素[11]，可以根据不同使用目的，分部位区别应用大黄药材。如减肥药品和食品可以考虑使用大黄叶茎和花茎，不仅本身口感较佳，不需要额外添加矫味剂，而且具有泻下作用的番泻苷含量适中，不会导致急性腹泻。对于大黄叶的急性毒性、长期毒性等方面的研究，本课题组将进一步探讨。
参考文献：
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[9] 韩雅珊，蔡同一，周山涛.食用大黄的生物化学成分及其利用[J].中国农业科学，1985，16（1）：92-95.
[10] 苏艳芳，郑旭，郑俊华.西方人认识大黄[J].北京医科大学学报， 1998，30（6）：54-55.
[11] 熊辉岩，张晓峰.唐古特大黄叶柄的营养成分分析[J].天然产物研究与开发，2003，15（6）：515-517.
（收稿日期：2017-02-13）
（修回日期：2017-03-24；编辑：陈静）
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更新时间：2025/3/10 17:13:10