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标题 苏木、川芎对PG—BE1干细胞样细胞标志蛋白ABCG2影响的体内研究
范文 王耀焓 张培彤 杨栋 韩海英 郭秀伟 祁鑫 张芸



摘要：目的 體内实验观察不同剂量苏木、川芎对肿瘤干细胞样细胞标志物ABCG2的影响。方法 将无血清培养获得的球细胞接种于裸鼠腋下，将裸鼠随机分为对照组、苏木高剂量组、苏木低剂量组、川芎高剂量组和川芎低剂量组，各给药组给予相应药物灌胃，21 d后检测抑瘤率，激光共聚焦、Western blot和RT-PCR分别检测瘤体ABCG2蛋白和mRNA表达。结果 经无血清培养获得的球细胞具有无限增殖、抗凋亡、高表达干细胞标志物等干细胞性能，川芎高、低剂量组可明显抑制瘤体生长（P<0.05），其中川芎低剂量组抑瘤率明显高于川芎高剂量组，苏木高、低剂量组虽对瘤体有一定的抑制作用，但差异无统计学意义（P>0.05）；与对照组比较，川芎低剂量组可明显抑制ABCG2蛋白的表达，苏木高、低剂量组对ABCG2蛋白表达均无抑制作用，除川芎低剂量组外，各给药组对ABCG2 mRNA表达均有上调作用。结论 低剂量川芎可能通过抑制肿瘤干细胞标志物ABCG2蛋白的表达，靶向杀伤肿瘤干细胞。
关键词：苏木；川芎；肿瘤干细胞；ABCG2蛋白
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.014
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）08-0060-06
Effects of Sappan Lignum and Chuanxiong Rhizoma on Expression of ABCG2 Protein of PG-BE1 Stem Like Cells in Vivo WANG Yao-han， ZHANG Pei-tong， YANG Dong， HAN Hai-ying， GUO Xiu-wei， QI Xin， ZHANG Yun （Department of Oncology， Guanganmen Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100053， China）
Abstract： Objective To observe the effects of different doses of Sappan Lignum and Chuanxiong Rhizoma on tumor stem cells marker ABCG2 in vivo. Methods Sphere cells obtained from serum culture were inoculated in nude mouse armpit， which were randomly divided into 5 groups： control group， Sappan Lignum high- and low-dose groups， and Chuanxiong Rhizoma high- and low-dose groups. Each medication group was given relevant medicine for gavage. 21 days later， inhibition tumor rate and ABCG2 protein and mRNA expression were detected with confocal microscope， Western blot， and RT-PCR. Results The sphere cells obtained from serum free culture had the abilities of cancer stem cells， such as proliferation， anti-aptosis and high expression of cancer stem cells markers. Chuanxiong Rhizoma high- and low-dose groups could inhibit tumor growth （P<0.05）， and the inhibitory rate of Chuanxiong Rhizoma low-dose group was higher than the Chuanxiong Rhizoma high-dose group. Sappan Lignum high- and low-dose groups inhibited tumor growth without statistical significiance （P>0.05）. Compared with the control group， Chuanxiong Rhizoma low-dose group could significantly inhibit the expression of resistant protein of ABCG2. Sappan Lignum high- and low-dose groups could not inhibit the protein expression of ABCG2. Each medication group up-regulated the mRNA expression of ABCG2 except for Chuanxiong Rhizoma low-dose group. Conclusion Low dose of Chuanxiong Rhizoma can inhibit the expression of ABCG2 protein levels， which can be the targeting killer for cancer stem cells.
Key words： Sappan Lignum； Chuanxiong Rhizoma； cancer stem cells； ABCG2 protein
基金项目：国家自然科学基金（81173450）
通讯作者：张培彤，E-mail：zhangpeitong@sohu.com
化疗在改善肿瘤患者生存质量、提高患者生存率方面起到重要作用。然而，化疗耐药的存在一直制约着临床疗效的发挥。有研究显示，经化疗后再复发或发生远处转移的乳腺癌患者，大约40%是由于化疗耐药引起的[1]。因此，寻找可以增强化疗敏感性的药物是目前面临的挑战。近几年来，肿瘤干细胞理论的提出对化疗耐药的治疗提出了新的理念。该理论认为，肿瘤干细胞具有自我更新、多向分化、化疗耐药等性能，是肿瘤复发及转移的主要原因。课题组前期研究表明，苏木、川芎嗪对肿瘤转移具有明显的抑制作用[2-3]。体内实验显示，苏木、鸡血藤及二者联合顺铂可以将肿瘤细胞阻滞在G0/G1期，并可抑制与细胞增殖相关的蛋白增殖细胞核抗原（PCNA）、低氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达，另外对P16-Cyclin D1- CDK4-RB途径也具有调节作用，三者相互作用共同阻滞肿瘤的发生发展[4-5]。基于以上研究基础，我们选用川芎、苏木作为活血的代表药，体内实验观察不同剂量苏木、川芎对肺癌干细胞样细胞的干预作用。ABCG2蛋白是目前比较公认的肿瘤干细胞标志物之一。因此，本实验主要研究在体内环境中不同剂量川芎、苏木对PG-BE1干细胞样细胞标志蛋白ABCG2的影响。
1 实验材料
1.1 动物
BALB/c-nu裸鼠，4～6周龄，体質量（16±2）g，雌雄各半，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SYXK（京）2013-0032，饲养于北京大学医学部实验动物中心。
1.2 细胞系
高转移性人巨细胞肺癌细胞PG-BE1，中国中医科学院广安门医院肿瘤研究室。
1.3 药物
苏木、川芎，康美药业股份有限公司；顺铂注射液，齐鲁制药（海南）有限公司，批号20120724。
1.4 主要试剂与仪器
Human FGF-basic（美国Pero Tech），Human EGF（美国Pero Tech），B27 Supplement（50×，美国Gibco），Tripsin inhibition from Glycine max（soybea，美国Sigma），Anti-BCRP/ABCG2抗体（美国Abcam），CCK8试剂盒（日本同人），ANNEXIN V（美国BD），ABCG2 Gene、Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG（H+L）、TRIzol Reagent（美国Life Technologies）。高速冷冻离心机（美国Sigma），NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国Thermo Scientific），PROGENE PCR扩增仪（英国Techene），Applied Biosysterns 7500 RT-PCR Systems（美国ABI），DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂），ChemiDoc XRS凝胶成像系统（美国Bio-Rad），ZEISS LSM710激光共聚焦显微镜（德国Zeiss），水平电泳槽（美国Bio-Rad）。
2 实验方法
2.1 药物制备、分组及给药
取苏木、川芎各15 g，双蒸水浸泡30 min，煎煮2次，将2次煎剂浓缩至60 mL，浓度0.25 g/mL，为高剂量药液。另取苏木、川芎各5 g，双蒸水浸泡30 min，将2次煎剂浓缩至100 mL，浓度0.05 g/mL，为低剂量4 ℃冰箱保存备用。将裸鼠随机分为对照组、川芎低剂量组、川芎高剂量组、苏木高剂量组、苏木低剂量组，每组5只，苏木低、高剂量和川芎低、高剂量小鼠给药剂量相当于成人（体质量60 kg）临床给药量10、30倍（成人每日临床给药量为苏木、川芎各10 g）。小鼠给药体积为200 μL/次，1次/d。
2.2 干细胞样细胞分选
常规复苏、培养PG-BE1细胞，待其生长至70%～80%时，胰酶消化成单个细胞，PBS清洗2次，重悬于含0.02 μg/mL EGF、0.02 μg/mL bFGF、5 μg/mL胰岛素、2%B27、4%BSA的DMEM/F-12的培养基，调整细胞浓度2×104/孔，接种于低黏附6孔板，待细胞成球且折光率变低时收集PG-BE1球细胞，离心、胰酶消化，1 mg/mL大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化，重悬于上述完全培养基DMEM/F-12中。使用传代至第3代的PG-BE1球细胞。
2.3 干细胞样细胞鉴定
2.3.1 CCK-8检测细胞增殖 分别收集PG-BE1贴壁细胞及第3代PG-BE1球细胞，接种于96孔板，1000个/孔，分为3、4、5、6、7 d组，每组5个复孔。分别于第3、4、5、6、7日时加入Cell Counting Kit-8细胞增殖检测试剂，10 μL/100 μL培养基，酶标仪检测吸光度（OD）。
2.3.2 AV/PI检测细胞凋亡 分别收集PG-BE1贴壁细胞及第3代PG-BE1球细胞，预冷的PBS清洗细胞2次，并重悬于1×Binding Buffer，调整细胞浓度至1×106/mL。取100 μL上述细胞悬液置于流式管中，加5 μL FITC Annexin V及5 μL PI。轻柔震荡细胞，室温（25 ℃）避光孵育15 min。每管加400 μL 1×Binding Buffer，流式细胞仪检测。
2.3.3 免疫荧光检测细胞ABCG2表达 分别收集PG-BE1贴壁细胞及第3代PG-BE1球细胞，调整细胞浓度至1×105/mL，接种于96孔板。24 h后，每孔依次加入4%多聚甲醛固定，0.1%Triton-X透膜，免疫荧光封闭液室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，荧光二抗避光孵育1 h，滴加DAPI避光孵育5 min，最后加入适量抗荧光淬灭封片液。
2.3.4 Western blot检测细胞ABCG2、SOX-2、Nanog、OCT-4表达 分别收集PG-BE1贴壁细胞及第3代PG-BE1球细胞，提取蛋白。BCA法测定各组总蛋白浓度，分别制备浓缩胶与分离胶，加样后分别行蛋白电泳、电转移，5%脱脂奶粉封闭后，一抗（稀释倍数1∶1000）、二抗（稀释倍数2∶1000）孵育各1 h，暗室中滴加超敏发光液，凝胶成像系统拍照。
2.4 川芎、苏木对裸鼠模型抑瘤率的影响
将1×107/mL浓度PG-BE1球细胞接种于裸鼠腋下，0.2 mL/只，24 h后，连续给药21 d，小鼠脱颈处死，称量瘤质量，计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（实验组平均瘤质量-对照组平均瘤质量）÷对照组平均瘤质量×100%。
2.5 激光共聚焦检测瘤体内ABCG2蛋白表达
将肿瘤组织从液氮中取出，冷冻切片包埋剂包埋，置于-20 ℃冰冻切片机中待其凝固；将已凝固肿瘤组织进行粗切片，直至露出肿瘤组织为止，切取8 μm厚度、完整的组织切片，平铺在防脱磨砂载玻片上，室温放置10 min；然后将玻片浸泡于4 ℃丙酮中，固定10 min；PBS冲洗3次×10 min；再将玻片浸泡于免疫封闭液中，封闭1 h；PBS冲洗3次，滴加一抗Anti-BCRP/ABCG2（按1∶100比例稀释），4 ℃过夜；PBS冲洗3次，滴加Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG（H+L）二抗（稀释浓度1∶200），室温避光孵育1 h；PBS冲洗，滴加DAPI，室温避光孵育5 min；PBS冲洗，滴加抗荧光淬灭封片液，盖玻片封片，激光共聚焦显微镜拍照。
2.6 Western blot检测肿瘤组织ABCG2蛋白表达
分别收集各组肿瘤组织，提取蛋白。用BCA法测定各组总蛋白浓度，分别制备浓缩胶与分离胶，加样后分别行蛋白电泳、电转移，5%脱脂奶粉封闭后，一抗（稀释倍数1∶1000）、二抗（稀释倍数2∶1000）孵育各1 h后于暗室中滴加超敏发光液，于ChemiDoc XRS凝胶成像系统拍照，并用Image J软件分析各组蛋白表达量。
2.7 RT-PCR检测肿瘤组织ABCG2基因表达
分别提取各组肿瘤组织RNA，应用Nanodrop测定RNA浓度与纯度，并验证RNA完整性。将提取的RNA进行反转录及荧光定量，检测各组基因表达量。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，符合正态分布用t检验，不符合正态分布用秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 干细胞样细胞分选结果
接种后第3日可见细胞球形成，随时间延长，球体积变大，折光率变低，传代至第3代的PG-BE1球细胞，见图1。
4.2 CCK-8法检测结果
PG-BE1球细胞组第3、4、5、6、7日OD值明显高于PG-BE1贴壁细胞（P<0.01）；以PG-BE1贴壁细胞OD值为基线，其PG-BE1球细胞第3、4、5、6、7日相对OD值分别为0.10、0.17、0.21、0.24、0.32，见图2。
4.3 AV/PI檢测结果
PG-BE1球细胞和贴壁细胞早期凋亡率分别为0.638%、1.273%（P<0.05）；中晚期凋亡率分别为2.53%、2.78%，PG-BE1球细胞中晚期凋亡率低于PG-BE1贴壁细胞（P>0.05），见图3。
4.4 免疫荧光检测结果
PG-BE1球细胞ABCG2高表达，而PG-BE1贴壁细胞ABCG2低表达甚至不表达，二者差异有统计学意义（P<0.05），见图4、图5。
4.5 Western blot检测结果
ABCG2蛋白在PG-BE1球细胞中表达量明显高于PG-BE1贴壁细胞（P<0.05）。OCT-4、Nanog在PG-BE1贴壁细胞中不表达或低表达，而在PG-BE1球细胞中可见明显表达（P<0.05）；SOX-2在PG-BE1球细胞及贴壁细胞中表达也有明显差异（P<0.01）。见图6。
4.6 不同剂量川芎、苏木对抑瘤率的影响
川芎高、低剂量组和苏木高、低剂量组抑瘤率分别为36.26%、42.63%、24.60%、26.32%。与对照组比较，川芎高、低剂量组可明显抑制瘤体生长（P<0.05），其中川芎低剂量抑瘤率明显高于川芎高剂量组（P<0.05）；苏木各剂量组虽对瘤体有一定的抑制作用，但差异无统计学意义（P>0.05）。见图7。
4.7 激光共聚焦检测不同剂量川芎、苏木对瘤组织ABCG2蛋白表达的影响
与对照组比较，苏木各剂量组ABCG2蛋白表达无明显差异，川芎各剂量组可明显抑制ABCG2蛋白的表达，见图8。
4.8 Western blot检测不同剂量川芎、苏木对ABCG2蛋白表达的影响
与对照组比较，川芎低剂量组可抑制ABCG2蛋白的表达（P<0.05），川芎高剂量组对ABCG2蛋白的表达无明显的抑制作用；苏木各剂量组对ABCG2蛋白表达均无抑制作用。见图9。
4.9 RT-PCR检测不同剂量川芎、苏木对ABCG2 mRNA表达的影响
与对照组比较，除川芎低剂量组外，各给药组对ABCG2 mRNA表达均有上调作用，见图10。
5 讨论
侧群（side population，SP）细胞可以特异性地将Hoechst33342染料快速泵出细胞外。研究发现，SP细胞具有某些干细胞特性，如具有极强的自我更新及增殖能力[6]。目前，在许多组织胚胎及肿瘤细胞中，都发现了SP细胞的存在[7-11]。他们具有与干细胞相似的干性，如同源性、自我更新能力、多向分化潜能。基于此，很多学者认为SP细胞中富含干细胞，是干细胞研究的重要资源，可以作为干细胞分离、鉴定的一种方法[12]。
而SP细胞之所以可以将Hoechst33342染料泵出细胞外，是因为ABCG2蛋白的存在。三磷酸腺苷结合盒（ATP binding cassette，ABC）超家族是一种由多种转运体组成的、在机体内广泛表达的大家族。ABCG2蛋白作为ABC家族成员之一，与SP细胞表型的表达存在密切关系，如ABC转运蛋白活性可被ABC转运蛋白抑制剂或者钙离子通路阻滞剂所抑制，从而减少SP表型[13]。Zhou S等[14]研究发现，虽然不同SP细胞来源于不同的组织，但均表达ABC家族中的ABCG2/BCRP1耐药基因，经反转录基因转染实验后发现，ABCG2/BCRP1的表达与SP细胞表型呈强相关，即ABCG2/BCRP1是SP细胞表型特征的决定因素。因此，认为ABCG2蛋白可以作为另一种肿瘤干细胞标志物用于肿瘤干细胞的鉴定。
本实验应用无血清培养法获得PG-BE1球细胞，经抗凋亡实验检测球细胞凋亡能力、CCK-8法检测球细胞增殖能力、Western blot检测干细胞标志物表达发现，该细胞具有较强的增殖能力、抗凋亡能力，高表达ABCG2、Nanog、OCT-4、SOX2等蛋白。而Nanog、OCT4、SOX2基因是干细胞中代表性标志物，与干细胞多潜能性和自我更新能力有密切关系，是目前肿瘤干细胞标志物之一。本实验中获得的PG-BE1球细胞在高表达SOX2、OCT-4、Nanog蛋白的同时高表达ABCG2蛋白，表明ABCG2蛋白作为肿瘤干细胞标志物的可靠性。以上体外实验结果表明，无血清球培养获得的PG-BE1球细胞具有肿瘤干细胞干性。
目前大量实验研究显示，中药提取物或中医复方在杀伤肿瘤干细胞方面存在较好疗效。研究发现异甘草素可以通过抑制肿瘤干细胞的自我更新及多向分化而明显降低乳腺癌细胞中SP及CSC的比率[15]。进一步研究发现，GRP78作为异甘草素的直接作用靶点，异甘草素可以剪短ATP表达域中GRP78的表达，进而抑制ATP酶的活性、促进β-catenin降解，导致β-catenin/ABCG2信号通路失活；体内实验也表明，异甘草素可通过GRP78/β-catenin/ABCG2信号通路增强乳腺癌干细胞的化疗敏感性，且对周围组织及乳腺干细胞无毒副作用。姜黄素通过诱导ABCG2耐药蛋白的低表达，提高乳腺癌干细胞对丝裂霉素的敏感性，达到杀伤乳腺癌干细胞、减少球细胞形成、低表达肿瘤干细胞标志物CD44+CD24-的目的。经姜黄素干预的乳腺癌细胞对紫杉醇、顺铂、阿霉素等化疗药的敏感性明显提高[16]。片仔癀对SP细胞分选出的结肠癌干细胞有显著的杀伤作用，且呈剂量依赖性。其可以抑制结肠癌干细胞活性及成球能力，深入研究发现片仔癀对肿瘤干细胞的杀伤作用与其可以抑制ABCG2 mRNA的表达有关[17]。
本研究以ABCG2蛋白作为肿瘤干细胞标志物，观察苏木、川芎体内实验对PG-BE1干细胞样细胞的作用，经激光共聚焦及Western blot检测发现，低、高剂量苏木及高剂量川芎对ABCG2蛋白并无抑制作用，而低剂量川芎可明显抑制ABCG2蛋白的表达。故而认为低剂量川芎对PG-BE1干细胞样细胞的生长有抑制作用。进一步经RT-PCR检测后发现，低剂量川芎组可明显抑制ABCG2 mRNA的表达，其余各組对ABCG2 mRNA表达均为上调作用，Western blot与RT-PCR的结果基本一致。因此，考虑低剂量川芎对ABCG2蛋白的抑制作用可能与其抑制ABCG2 mRNA的表达相关，低剂量川芎对PG-BE1干细胞样细胞杀伤作用可能是通过抑制ABCG2蛋白在mRNA水平的表达实现的，其具体机制尚需进一步研究。
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（收稿日期：2016-11-06）
（修回日期：2017-02-26；編辑：华强）
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更新时间：2025/3/14 21:01:01