| 标题 | 连花清瘟胶囊超高效液相指纹图谱研究 |
| 范文 | 陈育鹏+赵倩+王贵金+张水英+毕丹 摘要：目的 研究并建立连花清瘟胶囊指纹图谱。方法 采用超高效液相色谱法（UPLC），色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3（1.8 ?m，2.1 mm×100 mm），以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为239 nm，流速为0.3 mL/min，柱温为30 ℃。结果 建立连花清瘟胶囊指纹图谱，共标定了32个共有峰，指认了其中9个共有峰，分别为新绿原酸（4号峰，来源于金银花和鱼腥草）、绿原酸（6号峰，来源于连翘、金银花和鱼腥草）、隐绿原酸（8号峰，来源于金银花和鱼腥草）、异连翘酯苷A（15号峰，来源于连翘）、连翘酯苷A（20号峰，来源于连翘）、槲皮苷（23号峰，来源于鱼腥草）、异绿原酸C（24号峰，来源于金银花）、连翘苷（26号峰，来源于连翘）、甘草酸（31号峰，来源于甘草），10批连花清瘟胶囊指纹图谱的相似度均大于0.96。结论 本研究建立的方法具有良好的精密度、重复性和稳定性，为控制连花清瘟胶囊的质量提供了新方法。 关键词：连花清瘟胶囊；超高效液相色谱法；指纹图谱 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.12.019 中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）12-0077-04 Study on UPLC Fingerprints of Lianhua Qingwen Capsules CHEN Yu-peng1，2， ZHAO Qian1，2， WANG Gui-jin3， ZHANG Shui-ying1，2， BI Dan1，2 （1. Hebei Province Institute of Integrated Traditional and Western Medicine， Shijiazhuang 050035， China； 2. Beijing Yiling Pharmaceutical Co.， Ltd， Beijing 102600， China； 3. Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co.， Ltd， Shijiazhuang 050035， China） Abstract： Objective To study and establish the UPLC fingerprints of Lianhua Qingwen Capsules. Methods The samples were separated with a Waters ACQUITY UPLC HSS T3 column （100 mm × 2.1 mm， 1.8 ?m） by linear gradient elution. The wavelength for detection was set at 239 nm； mobile phase was set at a ?ow rate of 0.3 mL/min； the column temperature was set at 30 ℃. Results UPLC fingerprints of Lianhua Qingwen Capsules were established with 32 common peaks. 9 of 32 common peaks were identified， including neochlorogenic acid （peak No.4， source from Lonicerae Japonicae Flos and Houttuyniae Herba）， chlorogenic acid （peak No.6， source from Forsythiae Fructus， Lonicerae Japonicae Flos and Houttuyniae Herba）， cryptochlorogenic acid （peak No.8， source from Lonicerae Japonicae Flos and Houttuyniae Herba）， isoforsythiaside A （peak No.15， source from Forsythiae Fructus）， forsythoside A （peak No.20， source from Forsythiae Fructus）， quercitrin （peak No.23， source from Houttuyniae Herba）， isochlorogenic acid C （peak No.24， source from Lonicerae Japonicae Flos）， phillyrin （peak No.26， source from Forsythiae Fructus）， glycyrrhizic acid （peak No.31， source from Glycyrrhizae Radix et Rhizoma）. The similarities in 10 batches of Lianhua Qingwen Capsules samples were all above 0.96. Conclusion The method is with good precision， repeatability and stability， which can be used as a new means for the quality control of Lianhua Qingwen Capsules. Key words： Lianhua Qingwen Capsules； UPLC； fingerprints 基金項目：国家自然科学基金青年基金（81503231）；国家中药标准化项目（ZYBZH-C-HEB-12）；北京市科技计划“十病十药”中药专项（Z161100001816022） 通讯作者：毕丹，E-mail：bidan_2005@163.com 连花清瘟胶囊是由连翘、金银花等13味中药组成的复方制剂，为中药六类新药，有清热解毒、宣肺泄热作用，用于治疗流行性感冒属热毒袭肺证[1]。药理研究表明，连花清瘟胶囊体外抗甲型H3N2流感病毒，提高FM1株流感病毒感染小鼠平均存活时间，延长生存期，具有退热消炎、止咳化痰功效，可迅速缓解流感症状；提高细胞免疫和体液免疫功能，增强机体抗病康复能力[2-8]。目前的质量标准包含5个薄层鉴别和1个连翘苷含量测定项，由于中药复方制剂成分复杂，其作用往往是多种成分协同作用的结果，仅用1种成分作為含量测定指标不能全面反映连花清瘟胶囊的内在质量。 中药指纹图谱技术作为一种从整体上控制质量的手段，已被国内外广泛认可，许多现代色谱、光谱分析技术在中药指纹图谱测定中都有应用，HPLC指纹图谱是目前应用最多的一类，其具有分离效能高、分析速度快等优点，如运用二极管阵列检测器，可得到三维图谱，因而适合分析成分比较复杂、紫外光区有吸收的药物，尤其适用于成分差别较细微的单味药材及成分较为复杂的复方制剂[9-15]。与HPLC相比，超高效液相色谱（UPLC）具有分离度高、灵敏度高、分析时间短的特性，近几年广泛应用于中药指纹图谱的研究[16]。本试验采用UPLC建立连花清瘟胶囊的指纹图谱，作为连花清瘟胶囊质量控制的方法。 1 仪器与试药 美国Waters UPLC H-CLASS超高效液相色谱仪（PDA检测器，Empower 3.0色谱工作站），KQ-500DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），Milli-Q超纯水处理系统（Millipore Bedford，MA，美国），瑞士METTLER TOLEDO AL 204型电子分析天平，瑞士METTLER TOLEDO AB 135-S型电子分析天平，上海精科JA2603B电子天平。 连翘苷（中国食品药品检定研究院，批号110821- 201213，纯度95.3%），连翘酯苷A（中国食品药品检定研究院，批号111810-201304，纯度94.3%），新绿原酸（成都普瑞法科技开发有限公司，批号13112712，纯度≥98%），绿原酸（中国食品药品检定研究院，批号110753-201314，纯度96.6%），隐绿原酸（上海源叶生物科技有限公司，批号ZF0226BA14，纯度≥98%），异连翘酯苷A（上海源叶生物科技有限公司，批号YA0817HB14，纯度≥98%），异绿原酸C（中国食品药品检定研究院，批号111894-201102，纯度94.1%），槲皮苷（HWI ANALYTIK GMBH pharma solutions，批号HWI01112，纯度91.7%），甘草酸铵（Council of Europe-EDQM，批号1.1，纯度≥98%），甲醇（分析纯，天津市光复科技发展有限公司，批号2014年1月13日），磷酸（分析纯，天津市光复科技发展有限公司，批号2014年3月26日），甲醇（色谱纯，美国Fisher公司，批号124875），乙腈（色谱纯，美国Fisher公司，批号106246），连花清瘟胶囊（石家庄以岭药业股份有限公司，批号B1507010、B1507002、B1507005、B1507007、B1507008、B1507013、B1507014、B1507015、B1507017、B1507020）。 2 方法与结果 2.1 色谱条件 Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（1.8 ?m，2.1 mm×100 mm），以甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱（流动相B为甲醇，流动相C为乙腈，流动相D为0.1%磷酸溶液），见表1。检测波长为239 nm，流速为0.3 mL/min，柱温为30 ℃，进样量2 ?L。 2.2 对照品溶液的制备 取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异连翘酯苷A、连翘酯苷A、连翘苷、异绿原酸C、槲皮苷、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 mL分别含新绿原酸18.4 ?g、绿原酸27.2 ?g、隐绿原酸21.2 ?g、异连翘酯苷A 27.2 ?g、连翘酯苷A 21.6 ?g、连翘苷16.0 ?g、异绿原酸C 14.4 ?g、槲皮苷9.0 ?g、甘草酸铵24.4 ?g的混合溶液，即得。 2.3 供试品溶液的制备 取连花清瘟胶囊内容物适量，研细，取0.25 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。 2.4 药材提取溶液的制备 取连花清瘟胶囊原药材各0.5 g，加50%甲醇25 mL，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，取适量溶液，过滤，即得。 2.5 方法学考察 2.5.1 精密度试验 取同一批连花清瘟胶囊（批号B1507010）内容物，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，重复进样6次，直观观察各指纹图谱的全貌无明显变化，各主要色谱峰峰面积的RSD均小于5%，表明仪器的精密度良好。 2.5.2 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样，直观观察各指纹图谱的全貌无明显变化，测定各主要色谱峰峰面积的RSD均小于5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。 2.5.3 重复性试验 取同一批连花清瘟胶囊（批号B1507010）内容物6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，注入液相色谱仪检测，直观观察各指纹图谱的全貌无明显变化，测定各主要色谱峰峰面积的RSD均小于5%，表明方法重复性较好。 2.6 指纹图谱的建立及共有峰的鉴定 取10批连花清瘟胶囊样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析，得到10批连花清瘟胶囊的指纹图谱（见图1），并采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件对10批样品的指纹图谱进行分析，以S1为参照指纹图谱，采用中位数法对各指纹图谱色谱峰进行多点校正和自动匹配，确定共有峰32个。分别取供试品溶液、对照品溶液和药材提取溶液，在上述色谱条件下进样分析，将对照品溶液色谱峰的保留时间与供试品溶液和药材提取液的色谱峰保留时间以及紫外吸收光谱图进行比对（见图2），鉴定了供试品溶液中9个色谱峰：新绿原酸（4号峰，来源于金银花和鱼腥草），绿原酸（6号峰，来源于连翘、金银花和鱼腥草），隐绿原酸（8号峰，来源于金银花和鱼腥草），异连翘酯苷A（15号峰，来源于连翘），连翘酯苷A（20号峰，来源于連翘），槲皮苷（23号峰，来源于鱼腥草），异绿原酸C（24号峰，来源于金银花），连翘苷（26号峰，来源于连翘），甘草酸（31号峰，来源于甘草）。其中以出峰稳定、峰面积较大的20号色谱峰连翘酯苷A为参照峰。 2.7 指纹图谱相似度分析 采用国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件对10批连花清瘟胶囊品的指纹图谱进行分析，以S1（批号B1507002）为参照指纹图谱，采用中位数法对各指纹图谱色谱峰进行多点校正和自动匹配，计算相似度并生成对照指纹图谱（R），然后进行相似度计算，10批连花清瘟胶囊指纹图谱与对照指纹图谱相似度评价结果见表2。 3 讨论 本试验考察了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液3个流动相系统，结果表明甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相系统的色谱峰出峰较多，基线稳定，各峰分离度较好，因此最终选择甲醇-乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相系统。在该色谱条件下增加梯度洗脱有机相比例，并延长洗脱时间至140 min，结果表明，70 min后没有明显的色谱峰，因此流动相洗脱时间确定为70 min。 本试验分别考察了Waters ACQUITY UPLC CSH C18（1.7 ?m，2.1 mm×100 mm）、Waters ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 ?m，2.1 mm×100 mm）、Waters ACQUITY UPLC BEH shield RP C18（1.7 ?m，2.1 mm×100 mm）和Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（1.8 ?m，2.1 mm×100 mm）4种不同的色谱柱，比较不同色谱柱对各色谱峰分离度及峰形的影响。结果表明，只有使用Waters ACQUITY UPLCHSS T3 C18柱时，各色谱峰峰形及分离度较好。因此，本方法选择Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱。 本试验分别考察了甲醇、90%甲醇、70%甲醇、50%甲醇的提取效果，结果表明，50%甲醇作为提取溶剂所得的指纹图谱中色谱峰最多，峰面积较大，因此选择50%甲醇作为提取溶剂。比较了超声法和加热回流法2种提取方法，结果表明，超声提取和回流提取所得指纹图谱色谱峰的数目和强度没有明显区别，由于超声提取方法简便，因此选择超声提取方式。分别比较了超声提取20、30、40 min，结果表明，超声提取30 min与40 min所得指纹图谱中色谱峰数量较超声提取20 min多，且提取30 min和40 min所得指纹图谱的色谱峰无明显区别，因此最终确定超声提取时间为30 min。 本研究采用PDA检测器进行全波长扫描，比较200～400 nm所得的指纹图谱色谱图，结果在239 nm下检测的色谱图中色谱峰最多，因此确定检测波长为239 nm。考察了不同色谱柱温度25、30、35 ℃所得的指纹图谱色谱图，结果表明，色谱柱温度为30 ℃时，色谱图中的色谱峰数量最多且分离效果最好。 本研究按照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》[17]，采用UPLC对连花清瘟胶囊中非挥发性成分指纹图谱及技术参数进行研究，取得了较满意的结果，标定了32个共有峰，指认了其中9个共有峰，同时方法学考察其精密度、稳定性、重复性均良好，表明所建立的UPLC指纹图谱方法可行，运用指纹图谱相似度软件对连花清瘟胶囊UPLC指纹图谱进行了相似度计算，结果10批连花清瘟胶囊的指纹图谱相似度在0.970～0.999，表明各批次样品的成分无明显差异，整体质量有较好的稳定性，为客观评价连花清瘟胶囊质量提供一定依据。 中药复方是多味药、多组分、多因素构成的复杂体系，其化学成分的复杂性和多样性是其疗效的物质基础。为了更全面地控制连花清瘟胶囊的质量，本研究首次建立了连花清瘟胶囊的UPLC指纹图谱，方法简单、快捷，可较全面反映连花清瘟胶囊中化学成分信息，经初步验证，该方法能够用来控制本品的质量，确保产品批次间的稳定性、均一性，从而为控制连花清瘟胶囊的质量提供了新方法。 参考文献： [1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2015：945-946. 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