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正交试验法优选青刺尖总黄酮提取工艺研究

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夏海梅周志宏张菊赵远

摘要：目的?优选青刺尖总黄酮的提取工艺。方法?对青刺尖中黄酮类成分进行鉴别，加热回流提取法和索氏提取法提取青刺尖总黄酮，芦丁为对照品，紫外可见分光光度法考察两种提取方法下青刺尖总黄酮得率，选择提取率较高的方法进行下一步实验。考察提取时间、乙醇体积分数、液固比三个因素对青刺尖总黄酮提取率的影响，正交设计提取条件，筛选最优提取工艺。结果?相同条件下，加热回流提取法提取青刺尖总黄酮得率高于索氏提取法;选择加热回流提取法实验，得最佳提取工艺为：提取时间40min、乙醇体积分数60%、液固比12 mL/g;在此条件下三次重复实验得青刺尖总黄酮提取率为7.30%。结论?加热回流提取法提取青刺尖总黄酮优于索氏提取法，在提取时间为40min、乙醇体积分数60%、液固比12 mL/g的条件下青刺尖总黄酮得率高，该方法简单易行，可作为青刺尖总黄酮提取工艺。

关键词：青刺尖总黄酮;紫外可见分光光度法;提取工艺

中图分类号：R284.2?文獻标志码：B?文章编号：1007-2349（2021）01-0080-03

青刺尖，青刺尖（Prinsepia utilis Royle）当年生嫩尖及叶（下同）经烘炒、揉捻和干燥等工艺制作而成，蔷薇科扁核木属落叶灌木，别名扁核木、枪刺果、打油果（曲靖）、鸡蛋果（云南）等[1]。主要分布云南、贵州、四川、西藏等地[2]。云南地区主要分布于迪庆州维西县及周边州市，云南省滇西北特色生物资源。青刺尖始载于《滇南本草》，曰：“性散寒，味苦。”[3]，《云南天然药物图鉴》记载性味，苦、辛、凉[4]，在《贵州中草药》、《中药大辞典》、《云南民族药志》中也有记载。青刺尖根、茎、叶、果实均可入药，我省纳西族、白族、彝族、普米族、苗族等少数民族中已有上千年的应用历史，嫩叶水煎用于治疗咽喉炎、发热、牙痛、外痔出血、疮痈肿等[2]。目前对青刺尖总黄酮的提取工艺研究不多，吴小兰[5]以结晶法制备青刺果总黄酮，所得总黄酮含量为33.6%;张济麟[6]以有机溶剂提取青刺尖果中总黄酮，得总浸膏、乙酸乙酯层黄酮类化合物的含量分别为3.00%、2.76%，石油醚层和正丁醇层均为0.09%，水层0.03%;刘招娣等[7]以青刺果油粨为原料，超声波辅助法提取总黄酮，提取率为5.28%;以酶叶提取法提取扁核木茎叶中总黄酮，得1.379 mg/g[8];韩蕾[9]研究结果显示，蕤核叶黄酮的提取量可达到9.1237 mg·g-1;左爱华[10]以芦丁为对照品，紫外可见分光光度法测定青刺尖总黄酮，实验以80%乙醇加热回流提取，最终黄酮得率以丽江地区最高，3.10%。本实验筛选青刺尖总黄酮提取方法，再对提取工艺进行优选，旨在为产业化生产及药理研究提供参考。

1?仪器及试剂

1.1?仪器?TU-1900双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），DZTW调温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司），751石英比色皿10 mm（宜兴市中科工业玻璃有限公司光电科析仪器部），UPH-IV-20T纯水机（云南优普科技有限公司）

1.2?试剂?芦丁（上海奥克化学有限公司），产品编号：132390050，其他试剂均为分析纯，纯水自制。

1.3?试剂的配制?5%NaNO2的配制准确称取5.0 g亚硝酸钠，再加入95 ml去离子水，搅拌溶解即得。10% AL（NO3）3 的配制准确称量硝酸铝10.0 g放入150 ml锥形瓶中，然后用移液管移取90 ml去离子水，用玻璃棒搅匀即得。

4% NaOH的配制准确称取4.0 g氢氧化钠固体，加入96 g去离子水中，搅拌、溶解即得。

1.4?样品?购于丽江贡合实业有限公司，当年生嫩尖及叶经烘炒、揉捻和干燥等工艺制作而成，经粉碎成粗粉备用。

2?方法与结果

2.1?青刺尖中黄酮类化合物的鉴别

2.1.1?三氯化铝试验?取青刺尖样品溶液在滤纸上滴1滴，待干后加入1% ALCL3乙醇溶液3滴，待溶剂挥干后，观察是否有黄色络合物，紫外灯下观察是否出现鲜黄色荧光。观察实验结果，溶剂挥干后，有黄色络合物;紫外线分析仪下观察，呈鲜黄色荧光，表明青刺尖中含有黄酮类化合物。

2.1.2?盐酸镁粉试验?取青刺尖样品溶液1 mL，加入少许镁粉，振摇，滴入几滴浓盐酸，溶液显红色，表明含有黄酮类化合物。

2.2?对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品5.00 mg于25.00 mL容量瓶中，加70%乙醇水浴上微热溶解，加70%乙醇定容至刻度，即为浓度0.2000 mg/mL的对照品溶液。

2.3?标准曲线的制备?精密吸取对照品溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL分别置于25ml容量瓶中，编号0、1、2、3、4、5、6，加70%乙醇至6.00 mL，加5% NaNO2 1 mL，摇匀，静置6 min，加10% AL（NO3）3 1.00 mL混匀，静置6 min，加入4% NaOH 溶液10.00 mL，加入超纯水定容至刻度，摇匀，静置15 min后，以0号做对照，在510 nm处测定吸光度。以吸光度Y为纵坐标，质量浓度X（mg/mL）为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程为：Y=f（x），公式Y=K1*（x）+K0，其中K0=0.05382，K1=0.43482，R=0.9983，即Y=0.43482*（x）+0.05382。芦丁0.0081 mg/mL～0.0486 mg/mL浓度范围内线性良好。

2.4?提取方法的筛选?分别选用索氏提取法和加热回流提取法，以液料比10 mL/g，乙醇体积分数70%，加入青刺尖粗粉，浸泡30 min，提取青刺尖总黄酮，提取结束，每种提取方法下选择三个样品进行编号测定吸光度，计算平均值，选择黄酮得率较高的提取方法进行下一步实验。

C（μg/m L）：总黄酮的浓度;V（m L）：待测样品体积;D：稀释倍数;M（μg）：称取样品的质量。

计算青刺尖总黄酮提取率，索氏提取法和加热回流提取法青刺尖总黄酮提取率分别为2.81%、4.06%，加热回流提取法优于索氏提取法。

2.5?单因素试验?考察在不同乙醇体积分数、液固比、提取时间的影响因素下，青刺尖总黄酮的提取率。

2.5.1?体积分数对青刺尖总黄酮提取率的影响?精密称取青刺尖样品15 g，置于圆底烧瓶中，加入（30、40、50、60、70、75、80%）乙醇溶液150 mL浸泡30 min，连接回流装置，加热回流提取1 h，放凉，倾倒出药液，补足与药液同体积的乙醇，重复以上操作3次。提取结束后合并滤液，过滤，浓缩提取液至0.2 g生药/mL。将滤液转移至50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。精密吸取1 mL样品置于25 mL容量瓶中，自“加70%乙醇至6.00 mL”起按照标准曲线项下的操作进行。在510 nm波长处测定吸光度，并利用公式计算青刺尖总黄酮提取率，实验发现乙醇体积分数为50%时黄酮得率最高，为5.94%。结果如图1所示。

2.5.2?液固比对青刺尖总黄酮提取率的影响?准确称取青刺尖样品15 g置于圆底烧瓶中，以液固比（8、10、12、14、16）mL/g，加入50%乙醇溶液，浸泡30 min，连接回流装置，加热回流提取1 h，放凉，倾倒出药液，补足与药液同体积的乙醇，重复以上操作3次。提取结束后合并滤液，过滤，浓缩提取液至0.2 g生药/mL。将滤液转移至50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。精密吸取1 mL样品置于25 mL容量瓶中，自“加70%乙醇至6.00 mL”起按照标准曲线项下的操作进行。在510 nm波长处测定吸光度，并利用公式计算青刺尖总黄酮提取率。实验发现，液固比为12 mL/g时青刺尖总黄酮得率最高，为7.81%。实验结果如图2所示。

2.5.3?提取时间对青刺尖总黄酮提取率的影响?准确称取青刺尖样品15 g置于圆底烧瓶中，以液固比 1：10加入50%乙醇溶液浸泡30 min，连接回流装置，加热回流提取（40、55、70、85、100 min），放凉，倾倒出药液，补足与药液同体积的乙醇，重复以上操作3次。提取结束后合并滤液，过滤，浓缩提取液至0.2 g生药/mL。将滤液转移至50 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。精密吸取1 mL样品置于25 mL容量瓶中，自“加70%乙醇至6.00 mL”起按照标准曲线项下的操作进行。在510 nm波长处测定吸光度，并利用公式计算青刺尖总黄酮提取率，提取时间为70 min时，青刺尖总黄酮得率最高，为6.88%。结果如图3所示。

2.6?正交试验?选取单因素试验结果进行正交设计，优选最佳提取工艺，结果如表1所示。

由表5结果可知，提取时间40 min，液料比12 mL/g，乙醇浓度60%青刺尖总黄酮的提取率最高，达7.19%。由极差结果可知，在三个提取因素中，乙醇浓度对青刺尖总黄酮的提取率影响最大，依次为乙醇浓度>液固比>提取时间。在以上优选工艺条件下重复实验3次，平均提取率为7.3%。

3?讨论

本实验以提取时间、乙醇体积分数和液料比三个因素为考察对象，正交设计优选得到青刺尖总黄酮的最佳提取工艺：提取时间40min，液料比12ml/g，乙醇浓度60%，重复验证最佳工艺的总黄酮类提取率为7.30%，较文献报道3.10%高。据文献研究结果[10]，以紫外可见分光光度法考察青刺尖黄酮类化合物准确灵敏，本实验以该方法作為考察方法，可信度较高，所优选提取工艺较为可靠。

黄酮类化合物具有显著的降血脂活性，可有效应用于心血管疾病的防治。目前对青刺尖中黄酮类成分的药理研究较少，基于青刺尖的丰富资源及富含黄酮类成分的特性，对其进行深入的药理研究具有重要意义。

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[5]吴小兰.青刺果总黄酮的提取工艺及其对糖尿病小鼠降血糖效应的研究[D].成都：四川农业大学，2008.

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[9]韩蕾.蕤核叶黄酮类化合物提纯及抗氧化活性研究[D].临汾：山西师范大学，2013.

[10]左爱华，韦群辉，曾元儿，等.紫外可见分光光度法测定青刺尖总黄酮含量[J].云南中医中药杂志，2008（6）：43-44+84.

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（收稿日期：2020-06-24）

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