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标题

基于蛇床子配方颗粒的标准汤剂质量标准

范文

李军山李雪利高杰高晗张肖建孙福仁

摘要? 目的：对蛇床子饮片进行标准汤剂制备，并研究其质量标准。方法：按照中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求中的相关规定，对15批产自不同地区的蛇床子饮片进行标准汤剂制备，对其主含成分蛇床子素进行含量测定，计算15批标汤的出膏率及蛇床子素的含量转移率，并对高效液相色谱法（HPLC）特征图谱进行方法建立。结果：蛇床子素转移率为3.35% ～6.09%，出膏率为14.10% ～19.93%。对特征谱图中的8个特征峰中的5个色谱峰进行了指认。结论：蛇床子饮片标准汤剂符合中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求中的相关规定，测定方法精密度、稳定性和重复性良好，可以为蛇床子配方颗粒的质量控制提供参考。

关键词? 蛇床子;蛇床子素;标准汤剂;转移率;出膏率;含量测定;特征图谱;中药化学

Study on Quality Standard of Standard Decoction of Based on Shechuangzi Formula Granules

LI Junshan1，2，LI Xueli1，GAO Jie1，GAO Han1，ZHANG Xiaoian1，SUN Furen1

（1 Shineway Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Shijiazhuang 051430，China; 2 TCM Formula Granule Engineering Technology Research Center of Hebei，Shijiazhuang 050091，China）

Abstract Objective： To prepare the standard Shechuangzi Decoction Pieces and study its quality standard. Methods： According to the relevant provisions of the technical requirements for the quality control and standard formulation of Chinese medicine formula granules，a total of 15 batches of Shechuangzi Decoction Pieces from different origins were prepared for standard decoction.The content of osthole in its main component was determined，the cream extraction rate and the content transfer rate of osthole in 15 batches of standard decoction were calculated，and the HPLC characteristic map method was developed. Results： By analyzing the determination results of 15 batches of standard decoction of Shechuangzi Decoction Pieces，the transfer rate of osthole ranged from 3.35% to 6.09%.The extraction rate was 14.10%-19.93%.A HPLC characteristic atlas analysis was established，and 5 chromatographic peaks were identified from 8 characteristic peaks in characteristic atlas. Conclusion： The standard decoction of Shechuang zi Decoction Pieces meets the relevant regulations in the technical requirements for quality control and standard formulation of Chinese medicine formula granules.The determination method has good precision，stability and repeatability，and can provide reference for the quality control of the Shechuangzi Formula Granules

Keywords? Fructus Cnidii; Osthole; Standard decoction; Transfer rate; Extraction rate; Determination of content; Characteristic chromatograms; Chemistry of Chinese medicine

中圖分类号：R283 文献标识码：A? doi： 10.3969/j.issn.1673-7202.2020.14.005

蛇床子为伞形科植物蛇床 Cnidium monnieri （L.）Cuss.的干燥成熟果实，又名蛇米（《本经》）、蛇珠（《吴普本草》）、蛇床仁（《药性论》）、野茴香（江西《草药手册》）等。始载于《神农本草经》，列为上品[1-2]，李时珍谓：“蛇虺喜卧子下食其子，故有蛇床、蛇粟诸名”。香豆素类成分为蛇床子的主要药效成分，其中蛇床子素含量最高，约占总香豆素的60%，其他香豆素类成分有水合橙皮内酯、花椒毒素、花椒毒酚、欧芹属素乙、佛手柑内酯、白芷素等。用于阴痒带下，湿疹瘙痒，湿痹腰痛，肾虚阳痿，宫冷不孕。用量3～10 g，外用适量，多煎汤熏洗，或研末调敷[3-5]。研究表明，蛇床子对中枢神经系统、心血管系统、内分泌系统、免疫系统等均具有好的作用，常用于治疗外科、妇科、皮肤等方面的疾病[6]。

中药饮片标准汤剂可以标化不同的临床用药形式，提高临床用药的准确性和剂量的一致性[7]。配方颗粒的生产工艺参数、质量控制方法和有效指标成分的选择等方面研究均须匹配标准汤剂等的相关研究。本研究按照标准汤剂制备方法，以采收自15个不同产地的蛇床子饮片为原料制备标汤，对蛇床子素进行含量测定，计算蛇床子转移率和标汤出膏率范围，并建立特征图谱方法，为提高蛇床子配方颗粒的质量控制水平和规范其临床用药提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司，型号：CPA225D）;电子天平（余姚市纪铭称重校验设备有限公司，型号：JM-A5002）;水循环真空泵（上海申生科技有限公司）;热风循环鼓风干燥箱（太仓精宏仪器设备有限公司，型号：DHG-9140A）;高效液相色谱仪（日本岛津公司，日本，型号：LC-20AT）;超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，型号：KH3200E）。

1.2 试剂蛇床子素对照品（中国食品药品鉴定研究院，批号：110822-201710）;欧前胡素对照品（中国食品药品鉴定研究院，批号：110826-201616）;对香豆酸（成都普菲德生物技术有限公司，批号：17082310）;花椒毒素（成都普菲德生物技术有限公司，批号：HA061509198）;花椒毒酚（成都普菲德生物技术有限公司，批号：HX106886198）甲醇（成都普菲德生物技术有限公司，批号：20180820）;乙腈（天津科密欧化学试剂有限公司，色谱纯）;甲醇（天津科密欧化学试剂有限公司，分析纯）;水（实验室自制，去离子水）。

1.3 分析样品 15批不同产地蛇床子药材，经河北省药品检验研究院孙宝惠鉴定为正品，样品来源信息见表1。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相组成A（水）﹕B（乙腈）为35∶ 65;检测波长为322 nm。理论板数按蛇床子素峰计算应不低于3 000。

2.1.2 对照品溶液的制备取蛇床子素对照品10 mg，精密称定，加乙醇适量制成每l mL含20 μg的溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备取本品研细，称取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇25 mL，密塞，称重，超声处理30 min，放冷，再次称重，补足减失的重量，摇匀，滤过，即得[14-15]。

2.1.4 专属性试验取空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液，分别采用2.1.1色谱条件，进行HPLC色谱测定。样品与对照品在同一保留时间有相同的波峰出现，而空白溶液则无相应的峰，证明含量测定专属性良好。

2.1.5 线性关系考察精密吸取对照品溶液1.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，进样分析，记录蛇床子素峰面积，并以蛇床子素峰面积为纵坐标Y，进样蛇床子素的量为横坐标X，制作标准曲线。得回归方程Y=873 21X+462 7.5，r=0.999 9，结果表明蛇床子素在0.026 4～0.527 6 μg，范围内相关系数为0.999 9线性关系良好。

2.1.6 精密度试验取蛇床子标准汤剂样品（标1）按“2.2.3”所规定方法制备供试品溶液，连续进样6针，测定峰面积（蛇床子素）的RSD值为0.31%，说明设备具有良好的精密度。

2.1.7 供试品溶液稳定性试验取同一个供试品溶液，分别于0，3，6，9，12，15 h时进样测定蛇床子素含量，计算各样品中峰面积（蛇床子素）的RSD值为0.53%，说明15 h内此样品溶液稳定。

2.1.8 重复性试验取蛇床子标准汤剂样品（标1）供试品6份，每份约0.1 g，精密称定。按“2.2.3”所规定方法处理标汤剂样品，按“2.2.1色谱条件”进样测定，计算供试品中蛇床子素含量，6份供试品中蛇床子素含量的RSD为0.81%，表明该方法重复性良好。

2.1.9 回收率试验取蛇床子标准汤剂样品（标1）供试品9份，每份约0.05 g精密称定，按每3份为一组，每组精密加入蛇床子素对照品相当于蛇床子标准汤剂所含蛇床子素量的80%，100%，120%，置具塞锥形瓶中，按2.2.1色谱条件项下进样10 μL测定，蛇床子素平均加样回收率为100.80%，加样回收率RSD为1.51%。见表2。

2.1.10 样品测定结果按“称取蛇床子饮片200 g，以水为提取溶媒，提取2次[8]。第一煎加水1 600 mL，先泡30 min，然后开始加热，煮沸后计时30 min;第二煎加水1 200 mL，煮沸后计时20 min。合并2次煎液，用300目的筛网趁热过滤。滤液迅速冷却，用旋转蒸发器低温（60 ℃，-0.085 MPa）浓缩至适当相对密度的流浸膏，放置在玻璃蒸发皿中冷凍干燥，制成标准汤剂干燥粉末”[9-13]。所述方法制备15批标准汤剂，计算标准汤剂出膏率即为标准汤剂干燥粉末（m2）与蛇床子饮片（m1）：

出膏率= m2 m1

按“蛇床子及标准汤剂中蛇床子素含量的测定方法”测定蛇床子饮片、蛇床子标准汤剂的含量[14-15]：

含量转移率= 标准汤剂含量×出膏率饮片含量 ×100%

15批蛇床子标准汤剂出膏率在14.10% ～19.93%，出膏率平均值为15.84%，SD值为1.71;标准汤剂中蛇床子素含量范围为3.26～5.85 mg/g，含量平均值为4.63 mg/g，SD值为0.74;蛇床子素含量转移率范围为3.35% ～6.09%，转移率均值为4.72%，SD值为0.96。

2.2 特征图谱测定

2.2.1 色谱条件色谱柱：Agilent公司ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈-0.1%冰醋酸溶液[16]，按下表比例进行梯度洗脱;检测波长为310 nm;流速1 mL/min;柱温为30 ℃;进样量：10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备分别取蛇床子素、花椒毒素、花椒毒酚、欧前胡素和对香豆酸对照品适量，精密称定，加乙醇制成每l mL含蛇床子素30 μg、花椒毒素20 μg、花椒毒酚20 μg、欧前胡素10 μg、对香豆酸20 μg的混合溶液[17-18]，即得。见图1。

2.2.3 供试品溶液的制备取本品0.2 g，精密称定，置磨口三角瓶中，精密量取70%乙醇25 mL，加入三角瓶中，称重，密塞，超声处理20 min，放冷，再次称重，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得[19]。见图2。

2.2.4 精密度试验取蛇床子标准汤剂样品（标1），按“2.2.3”所述方法处理样品，重复进样6次，以蛇床子素为S峰，计算其他主要色谱峰的RRT及RPA，结果显示各峰RRT的RSD<0.9%，RPA的RSD<2.9%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 供试品溶液稳定性试验取同一批标汤制备的样品溶液，按“2.2.1色谱条件”规定，分别在0，3，6，9，12，15，18 h进样分析，记录色谱图，以蛇床子素为S峰，计算其他主要色谱峰的RRT及RPA，结果显示各峰RRT的RSD<0.6%，RPA的RSD<2.7%，表明在18 h内样品溶液稳定。

2.2.6 重复性试验取蛇床子标准汤剂样品（标1），按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，制备平行样品6份，按2.2.1所述条件，进样分析，记录色谱图，以蛇床子素为S峰，计算其他主要色谱峰的RRT及RPA，结果显示各峰RRT的RSD<1.1%，RPA的RSD<3.0%。

2.2.7 样品测定结果取15批蛇床子标准汤剂，按2.2.1色谱条件测定HPLC图谱。测定完后把15批HPLC图谱导入相似度评价系统软件中进行分析。见图3。15批蛇床子标准汤剂共呈现8个共有特征峰，以8号峰蛇床子素为参照峰，计算8个共有色谱峰的RRT及RPA。见表5、表6。

结果表明，15批蛇床子标准汤剂各特征峰的RRT均在规定值：峰1（0.20）、峰2（0.29）、峰3（0.33）、峰4（0.35）、峰5（0.58）、峰6（0.61）、峰7（0.96）、峰8（1.00）±5%范围内。

3 讨论

3.1 提取溶剂考察蛇床子配方标准汤剂特征图谱样品制备方法考察了纯化水、无水乙醇、100%甲醇、70%甲醇、20%甲醇、70%乙醇、20%乙醇共7种提取溶剂，以色谱峰个数、基线稳定性等为考察指标，最终确定用70%乙醇进行样品溶液制备。

3.2 流动相选择特征图谱在条件摸索阶段有机相考察了流动相：甲醇[20]、乙腈，水相考察了0.1%磷酸，0.1%冰醋酸及水，通过对比色谱图发现流动相为乙腈-0.1%冰醋酸时，色谱图基线平稳，色谱峰分离良好，因此选用乙腈-0.1%冰醋酸作为流动相。

3.3 色谱柱及柱温考察了ZORBAX Eclipse Plus C18及InertSustain AQ-C18，柱温25 ℃、30 ℃、35 ℃，结果显示ZORBAX Eclipse Plus C18，柱温30 ℃时效果最优。

3.4 提取用纯化水、饮用水考察先后考察了纯化水、饮用水提取的差异，饮用水提取出膏率为15.30%，蛇床子素含量为3.17 mg/g，含量转移率为4.58%;纯化水提取出膏率为14.98%，蛇床子素含量为3.59 mg/g，含量转移率为5.07%，从实验结果可以看出提取效果受加水量多少影响较小。

3.5 煎煮时间考察考察了一煎20/二煎20 min、一煎30/二煎20 min、一煎40/二煎30 min及一煎60/二煎40 min，结果出膏率为14.76%、15.31%、15.52%、15.50%，蛇床子含量转移率为3.21%、3.98%、3.63%、3.70%，标汤中蛇床子素含量转移率和出膏率呈先上升后趋于平稳的状态。

3.6 加水量考察考察了8/6倍、10/8倍、11/9倍、15/13倍及20/18倍加水量对提取效果影响，结果出膏率为15.30%、16.41%、17.14%、18.31%、19.09%，蛇床子素含量转移率为4.58%、4.79%、6.52%、8.47%、10.06%，标汤中出膏率随加水量增加有提升，蛇床子含量转移率亦有上升趋势，所以标准汤剂制备方法应该统一。

我们根据中药配方颗粒标准制定相关要求，制备了15批蛇床子标准汤剂，并对标汤出膏率及蛇床子素转移率进行了测定，同时确定了特征图谱测定方法及评价指标，建立了蛇床子标准汤剂质量标准，为确定蛇床子配方颗粒生产及质量标准提升奠定基础。

参考文献

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（2019-03-19收稿责任编辑：杨觉雄）

基金项目：河北省科技计划项目（16272510）;河北省重点研发计划项目（17272505D）

作者简介：李军山（1965.01—），男，本科，正高级工程师，技术总监，研究方向：从事配方颗粒质量标准及制备工艺研究，E-mail：swljs@sina.com

通信作者：李雪利（1988.04—），女，本科，工程师，工艺研究员，研究方向：从事配方颗粒质量标准及制备工艺研究，E-mail：lixuelisherly@163.com

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