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绝经后妇女不同中医证型膝骨关节炎关节软骨ERRα/SOX9信号通路表达分析

范文

李朋李钊罗天胡仕畅霍少川

摘要目的：探討ERRα/SOX9信号通路在绝经后妇女不同证型膝骨关节炎（KOA）关节软骨中的作用。方法：选取2018年6月至2019年4月广州中医药大学第三附属医院收治的绝经后KOA患者，根据中医证型标准分为风寒湿痹证、风湿热痹证、瘀血闭阻证和肝肾亏虚证4组，采用RT-PCR和Western Blot检测ERRα/SOX9信号通路表达情况。结果：各组间膝关节软骨组织ERRα、SOX9和Col2α1表达量比较差异有统计学意义（P<0.05）。与风寒湿痹组比较，风湿热痹组ERRα、SOX9和Col2α1表达量之间差异无统计学意义（P>0.05）;瘀血痹阻组ERRα表达量升高，SOX9、Col2α1表达量降低（P<0.05）;肝肾亏虚组ERRα、Col2α1表达量降低（P<0.05），SOX9表达量升高（P<0.05）。与风湿热痹组比较，瘀血痹阻组ERRα表达量升高，SOX9、Col2α1表达量降低（P<0.05）;肝肾亏虚组ERRα、Col2α1表达量降低（P<0.05），SOX9表达量升高（P<0.05）。与瘀血痹阻组比较，肝肾亏虚组ERRα、Col2α1表达量降低（P<0.05）;SOX9表达量升高（P<0.05）。结论：绝经后妇女不同中医证型KOA患者关节软骨组织ERRα/SOX9信号通路存在差异，揭示不同证型ERRα/SOX9信号通路的差异将为中医药辨证施治绝经后KOA提供理论基础。

关键词膝骨关节炎;ERRα/SOX9信号通路;绝经后妇女;关节软骨;中医辨证分型;

Analysis of ERR a /SOX9 Signaling Pathway in Articular Cartilage of Postmenopausal

with Different Traditional Chinese Medicine Syndromes of Knee Osteoarthritis

LI Peng1，LI Zhao1，LUO Tian1，HU Shichang2，HUO Shaochuan3

（1 Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510240，China;

2 Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510450，China; 3 The First Affiliated

Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

Abstract Objective：To investigate the role of ERRa /SOX9 signaling pathway in postmenopausal women with different types of knee osteoarthritis articular cartilage.Methods：Postmenopausal KOA patients admitted to Third Affiliated Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine were selected as the research objects and were divided into 4 groups according to TCM syndrome type criteria：wind-cold-dampness arthralgia syndrome，wind-dampness-heat arthralgia，blood stasis arthralgia syndrome，and liver-kidney deficiency syndrome.Rt-pcr and Western Blot were used to detect the ERR alpha /SOX9 signal pathway expression.Results：The difference of ERR-alpha，SOX9 and Col2-alpha-1 expression was statistically significant（P<0.05）.Compared with wind-cold-dampness arthralgia group，there was no statistically significant difference in the expression of ERRα，SOX9 and Col2α1 in wind-dampness-heat arthralgia groups（P<0.05）.Compared with the blood stasis arthralgia瘀血痹阻 group，there was no significant difference in the expression of ERRα，SOX9 and Col2α1 in the wind-dampness-heat arthralgia group（P>0.05）; the expression of ERRα increased in the blood stasis arthralgia group，and the expression of SOX9 and Col2α1 decreased（P<0.05）; the expression of ERRα and Col2α1 in the liver and kidney deficiency group decreased（P<0.05），and the expression of SOX9 increased（P<0.05）.Compared with the wind-dampness-heat arthralgia，the expression of ERRα in the blood stasis arthralgia increased，and the expression of SOX9 and Col2α1 decreased（P<0.05）; the expression of ERRα and Col2α1 in the liver and kidney deficiency group decreased（P<0.05），and the expression of SOX9 increased（P<0.05）.Compared with blood stasis arthralgia group，the expression of ERRα and Col2α1 in the liver and kidney deficiency group decreased（P<0.05）; the expression of SOX9 increased（P<0.05）.Conclusion：There are differences in the ERR alpha /SOX9 signaling pathways in the articular cartilage of postmenopausal women with different TCM syndromes of KOA.The discovery of the differences in the ERR alpha /SOX9 signaling pathways between different syndroms of KOA provides a theoretical basis for TCM syndrome differentiation in the treatment of post-menopausal KOA.

Keywords Knee Osteoarthritis; ERR a /SOX9 signaling pathway; Postmenopausal; Articular cartilage; TCM syndrome differentiation

中图分类号：R271.9;R274.9;R274.32文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.02.027

膝骨关节炎（Knee Osteoarthritis，KOA）是一种以膝关节疼痛、关节僵硬、活动受限甚至关节畸形为主要临床症状，是以膝关节的关节软骨损伤、关节软骨下骨外露、关节骨赘生成、关节间隙变窄等为病理改变的膝关节退行性疾患，也是中老年人的常见病和多发病，其发病率随年龄增长逐渐升高，在中国，从40岁开始发病率逐渐升高，60～70岁达到高峰，65岁及以上的老年人发病率高达75%[1-2]。其主要表现为双侧膝关节疼痛和僵硬、关节肿胀和变形、股四头肌无力和消瘦等症状和体征，严重影响患者生活和工作[3]。KOA属中医“痹证”范畴，依据“国家中医药管理局‘十一五重点专科协作组膝痹病（膝关节骨性关节炎）诊疗方案[4]将KOA分为风寒湿痹证、风湿热痹证、瘀血闭阻证和肝肾亏虚证，不同证型膝关节疼痛程度具有差异性[5]，且血清炎性反应指标表达量也存在差异[6]。妇女绝经后雌激素水平降低，改变了骨与软骨代谢，继而引发关节软骨退变加速，导致KOA发病率明显增加[7]。研究发现，ERRα/SOX9信号通路参与KOA关节软骨病变[8-10]，但其在绝经后不同证型KOA关节软骨中表达情况目前仍不明确。因此，本研究通过检测绝经后不同中医证型KOA患者软骨组织中ERRα、SOX9和Col2α1表达水平，探讨ERRα/SOX9信号通路与KOA中医证型之间的内在联系，希望能够为KOA的临床辨证分型及治疗康复提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年6月至2019年4月广州中医药大学第三附属医院住院的50～70岁绝经后KOA患者40例，根据“国家中医药管理局‘十一五重点专科协作组专家集体研究的膝痹病（膝关节骨性关节炎）诊疗方案[4]将KOA中医证型分为肝肾亏虚、瘀血闭阻、风寒湿痹、风湿热痹4组，每组10例。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准本研究按照2007年中华医学会骨科学分会修订的KOA标准[11]：1）近1个月内反复膝关节疼痛;2）X线片（站立位）示关节间隙变窄、软骨下骨硬化和（或）囊性变、关节缘骨赘形成;3）关节液（至少2次）清亮、黏稠，WBC<2 000个/mL;4）中老年患者（≥40岁）;5）晨僵≤30 min;6）活动时有骨摩擦音（感）。综合临床、实验室及X线检查。如果患者具备1）、2）或1）、3）、5）、6）或1）、4）、5）、6）则此受试者KOA疾病诊断即成立。

1.2.2 中医证型参照“国家中医药管理局‘十一五重点专科协作组专家集体研究的膝痹病（膝关节骨性关节炎）诊疗方案[4]，将KOA的中医证型分为以下4个证型，具体的证候表现如下所示：1）风寒湿痹证：表现为肢体关节酸楚疼痛、痛处固定，有如刀割或有明显重着感或患处表现肿胀感，关节活动欠灵活，畏风寒，得热则舒。舌质淡，苔白腻，脉紧或濡。2）风湿热痹证：表现为起病较急，病变关节红肿、灼热、疼痛，甚至痛不可触，得冷则舒为特征;可伴有全身发热，或皮肤红斑、硬结。舌质红，苔黄，脉滑数。3）瘀血闭阻证：表现为肢体关节刺痛，痛处固定，局部有僵硬感，或麻木不仁，舌质紫暗，苔白而干涩，脉弦涩。4）肝肾亏虚证：表现为膝关节隐隐作痛，腰膝酸软无力，酸困疼痛，遇劳更甚，舌质红、少苔，脉沉细无力。

1.3 纳入标准 1）符合西医诊断标准和中医证型;2）近3个月内未接受过相关治疗;3）患者及家属知情同意。

1.4 排除标准 1）纳入对象合并有其他关节疾病，例如骨肿瘤、类风湿性关节炎、关节结核、化脓性关节炎以及关节内的骨折急性期等;2）纳入对象合并有心血管、脑血管、肺部、肝、肾、造血系统、内分泌系统、恶性肿瘤等严重原发性疾病及精神病患者。

1.5 脱落与剔除标准纳入对象膝关节腔内注射药物，如注射玻璃酸钠或激素等。

1.6 研究方法

1.6.1 RT-PCR方法检测ERRα、SOX9、Col2α1 mRNA表达对各组软骨组织处理后进行提取总RNA，以1 μg RNA合成cDNA，GAPDH作為内参基因，分别来扩增ERRα，SOX9，PGC1α和Col2α1基因。RT-PCR的反应体系为20 μg，设定反应条件为：95 ℃预变性90 s后进行PCR循环，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共进行40个循环;在扩增反应结束时，可从65 ℃缓慢加热至95 ℃，并建立PCR产物的溶解曲线。采用2-△△CT相对定量法来计算各组基因表达情况并进行统计学分析。

1.6.2 Western Blot方法检测ERRα、SOX9、Col2α1蛋白表达将各组软骨组织消化后移至1.5 mL离心管中，离心（10 000×g，5 min，4 ℃），弃上清液，加入裂解液（RIPA∶PMSF=100∶1），匀浆器匀浆5 min（30次/s），快速离心30 s，将管壁上的液体离心至离心管的底部。冰上裂解1 h后离心（10 000×g，5 min，4 ℃），用BCA工作液测定蛋白浓度后，取5×Loading buffer加入蛋白液中（Buffer：蛋白液=1∶4）混合均匀后100 ℃金属浴5 min使蛋白变性。将蛋白样品按照蛋白定量结果按照等体积（每个样品10 μL）进行蛋白量上样。250 V恒压，电泳30 min。电泳结束后利用恒定电流240 mA，2 h进行湿转。转膜结束后将PVDF膜移至5%脱脂奶粉中，37 ℃摇床摇动封闭2 h。5%脱脂奶粉稀释ERRα（1∶1 000;Proteintech）、SOX9（1∶2 000，Proteintech）、PGC1α（1∶500;Proteintech），Col2α1（1∶500;Proteintech），B-Actin（1∶3 000;Proteintech）杂交袋密封转移膜，室温1.5 h或者4 ℃过夜。将膜至于含有1×TBST的孵育盒中，在室温下摇动，漂洗5次，5 min/次，将未结合的一抗洗净。用5%脱脂奶粉稀释牛抗兔IgG（1∶3 000;美国SantaCruz公司）或羊抗鼠IgG（1∶3 000;美国SantaCruz公司），杂交袋密封转移膜，在室温下摇动1 h。将膜至于含有1×TBST的孵育盒中，在室温下摇动，漂洗5次，5 min/次，将未结合的二抗洗净。将ECL发光液A和B等比例加入曝光盒中混匀，将蛋白膜放入盒子中摇动3 min。吸干膜上液体，将其放入透明的薄膜中。利用Image Lab系统进行曝片。

1.8 统计学方法采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，每个实验重复至少3次，各组间比较采用单因素方差分析，以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组软骨组织中ERRα、SOX9和Col2α1 mRNA表达各组间膝关节软骨组织ERRα、SOX9和Col2α1 mRNA表达量比较差异有统计学意义（P<0.05）。与风寒湿痹组比较，风湿热痹组ERRα、SOX9和Col2α1 mRNA表达量之间差异无统计学意义（P>0.05）;瘀血痹阻组ERRαmRNA表达量升高，SOX9、Col2α1 mRNA表达量降低（P<0.05）;肝肾亏虚组ERRα、Col2α1 mRNA表达量降低（P<0.05），SOX9 mRNA表达量升高（P<0.05）。与风湿热痹组比较，瘀血痹阻组ERRαmRNA表达量升高，SOX9、Col2α1 mRNA表达量降低（P<0.05）;肝肾亏虚组ERRα、Col2α1 mRNA表达量降低（P<0.05），SOX9 mRNA表达量升高（P<0.05）。与瘀血痹阻组比较，肝肾亏虚组ERRα、Col2α1 mRNA表达量降低（P<0.05）;SOX9 mRNA表达量升高（P<0.05）。见表1，图1。

2.2 各组软骨组织中ERRα、SOX9和Col2α1蛋白表达各组间膝关节软骨组织ERRα、SOX9和Col2α1蛋白表达量比较差异有统计学意义（P<0.05）。与风寒湿痹组比较，风湿热痹组ERRα、SOX9和Col2α1蛋白表达量之间差异无统计学意义（P>0.05）;瘀血痹阻组ERRα蛋白表达量升高，SOX9、Col2α1蛋白表达量降低（P<0.05）;肝肾亏虚组ERRα、Col2α1蛋白表达量降低（P<0.05），SOX9蛋白表达量升高（P<0.05）。与风湿热痹组比较，瘀血痹阻组ERRα蛋白表达量升高，SOX9、Col2α1蛋白表达量降低（P<0.05）;肝肾亏虚组ERRα、Col2α1蛋白表达量降低（P<0.05），SOX9蛋白表达量升高（P<0.05）。与瘀血痹阻组比较，肝肾亏虚组ERRα、Col2α1蛋白表达量降低（P<0.05）;SOX9蛋白表达量升高（P<0.05）。见表2，图2、图3。

3 讨论

中医学认为，KOA属于“膝痹病”范畴，本病是骨伤科临床的常见病，多发病[12]。《张氏医通》阐述了膝痹病“本虚标实、虚实夹杂”的病理特点以及膝痹病与脏腑之间的相互关系。认为“膝为筋之府，膝痛无有不因肝肾虚者，虚则风寒湿气袭之”，《景岳全书》对“膝痹病”进行了详细的描述，认为病因考虑为“风寒湿三气流注之”。目前KOA的中医证型存在多种分型方法，证型仍未统一。《中医病症临床诊断标準》将KOA症候规定为肾虚髓亏型、阳虚寒凝型、瘀血阻滞型之外，还存在兼夹证型，包括肾虚髓亏合并阳虚寒凝型、阳虚寒凝合并瘀血阻滞型、肾虚髓亏合并瘀血阻滞型。但临床实践中发现KOA患者因其生活习惯、地域环境、气候因素以及年龄等具体病情可表现为不同的具体证候类型，或单一证型，或多证组合的复合证候并非完全是单一证候[13]。本研究依据“国家中医药管理局‘十一五重点专科协作组膝痹病（膝关节骨性关节炎）诊疗方案[4]将KOA分为风寒湿痹证、风湿热痹证、瘀血闭阻证和肝肾亏虚证4个证型，通过观察不同证型之间分子生物学差异，准确地概括病理实质，对于提高KOA辨证论治水平以及治疗有着重要意义。

KOA关节软骨磨损、退化甚至丧失，软骨下骨囊性变及硬化，关节边缘骨质增生，滑膜出现不同程度的炎性反应。其病变过程是由炎性反应及代谢因子等一系列问题所导致的膝关节软骨损伤和疼痛的过程。在不同KOA证型中，以血瘀为主的实证和以肾虚寒凝型为主的虚实夹杂症与疼痛程度相关性较高，以气虚亏虚型为主的虚证的临床表现越明显，其疼痛的程度就越低或越不明显[5]。KOA患者血清中炎性反应因子白细胞介素1（IL-1）、IL-6及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的浓度较常人明显升高，其中瘀血阻滞型中IL-1、IL-6血清浓度最高，而在阳虚寒凝型及风寒湿痹型中TNF-α的浓度较高[6]，解释了以瘀血、阳虚寒凝型及风寒湿痹型KOA患者膝关节不同程度疼痛的原因。鲍启忠等[14]对KOA患者血清内细胞因子和炎性反应因子进行了深入分析，结果发现KOA不同中医证型中风寒湿痹型患者的Wnt-3α和BMP-2表达量明显高于肝肾阴虚型、脾肾阳虚型和气滞血瘀型患者;风寒湿痹型患者TNF-α表达量明显高于肝肾阴虚型、脾肾阳虚型和气滞血瘀型患者;各中医证型IL-6、CRP和ESR比较差异无统计学意义。本研究探讨绝经后不同KOA证型患者关节软骨组织ERRα/SOX9/Col2α1信号通路差异，将为中医药辨证施治绝经后KOA提供分子生物学机制。

目前研究表明，ERRα具有维持软骨内稳态的特性，在对OA软骨细胞反应时具有复杂和综合的作用。软骨细胞中ERRα与关节软骨的形成、软骨寿命期间内组织的维持和完整性有关[15]。研究发现SOX9是软骨细胞产生软骨基质所必需的转录因子，可以调节软骨细胞外基质基因的表达[16]。实验表明Ⅱ型胶原是软骨的主要结构蛋白，约占细胞外软骨基质的50%[17]，具有抗拉伸强度和冲击吸收的特性[18]，Col2α1属于2型胶原的α1链，其突变可导致骨性关节炎发生。研究发现，SOX9是ERRα靶基因，敲除ERRα损害SOX9、Col2a1基因表达，引起咽弓异常软骨形成[15，19]。本研究发现，风寒湿痹型和风湿热痹型与风寒湿痹型比较ERRα表达量升高，SOX9、Col2α1表达量降低;风寒湿痹型和风湿热痹型与肝肾亏虚型比较ERRα、Col2α1表达量降低，SOX9表达量升高;与瘀血痹阻型比较，肝肾亏虚型ERRα、Col2α1表达量降低;SOX9表达量升高。

总之，绝经后妇女不同中医证型KOA患者关节软骨组织ERRα/SOX9信号通路表达存在差异，本研究初步阐释了绝经后KOA患者不同中医证型的分子生物学机制，将为中医药辨证施治绝经后KOA提供理论基础。

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（2019-12-10收稿责任编辑：王明）

基金项目：广东省中医药局科研项目（20181140）

作者简介：李朋（1982.03—），男，硕士，主治医师，研究方向：骨关节方向，E-mail：156564414@qq.com

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