| 标题 | 糖尿病肾病足细胞损伤机制及中药对其保护作用的研究进展 |
| 范文 | 潘柳叶 杨发奋 庞君 农生斌 卢棉 【关键词】 中药;足细胞损伤;糖尿病肾病 中图分类号：R587.2 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.11.016 随着我国糖尿病（DM）发病率逐年攀升，预计到2025年，我国糖尿病增长率将接近发达国家2倍。糖尿病肾病（DN）继发于DM，以蛋白尿为突出表现，最终发展至终末期肾病（ESRD）。足细胞（podocyte）是肾小球基底膜（GBM）外侧的高分化细胞，有Nephrin、Podocin等多种裂隙膜蛋白构成肾小球滤过的屏障，膜蛋白的损伤或缺失可引起大量蛋白尿。近年研究发现，足细胞损伤是DN发生、发展的关键环节之一。 1 足细胞损伤机制 1.1 糖、脂质代谢异常及胰岛素抵抗（IR） 高浓度葡萄糖引起的肾小球高压力、高滤过状态可直接使足细胞受损。高糖环境下，通过非酶糖化生成的糖基化终末产物（AGEs）增多，AGEs在肾脏中消除，通过细胞内吞噬及降解作用，AGEs被重吸收、降解或从尿中排出。随着DN患者肾功能的减退，AGEs消除受到影响，产生大于消除，AGEs在体内的蓄积，继续加重肾脏损害，形成一个恶性循环[1]。研究发现，足细胞凋亡部分是由于AGEs与抗糖基化终末产物受体（RAGE）结合激活肾素-血管紧张素系统（RAS），而RAGE高表达也可进一步激活RAS[2]。因此，我们认为当发生DN时，生成过多的AGEs与RAGE结合并持续激活RAS，是造成足细胞损伤和终末期肾病发生发展的主要原因。脂代谢紊乱或顽固的高脂血症可能对肾脏造成直接损害。国外研究人员观察150名肥胖儿童后发现，有22名儿童尿中出现了微量白蛋白，提示肥胖与微量白蛋白尿关系密切[3]。沈健等人[4]予高脂喂养小鼠4周，小鼠逐渐出现糖耐量受损和尿微量白蛋白，肾组织出现典型病理损害，进一步检测发现小鼠足细胞骨架蛋白Synaptopodin转为低表达，表明高脂环境可通过破坏细胞结构及功能的稳定，诱导足细胞凋亡。炎症加高脂环境下，足细胞内胆固醇、脂质水平升高，通过C型1类尼曼-匹克蛋白（NPC1）向内质网转运胆固醇增多，当内质网上的胆固醇过载时，内质网蛋白质加工运输障碍及Ca跨膜运动异常，内质网应激（ERS）的诱发加重了足细胞损伤。而他汀类药物不仅能减少足细胞内脂质沉积，降低NPC1表达，还能显著降低尿蛋白[5]。IR是胰岛素作用于组织细胞时，机体对其低应答，需过量的胰岛素才能发挥正常的降糖功能的病理过程。大剂量胰岛素可加剧慢性肾衰患者蛋白尿，还可刺激还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶表达增加，导致足细胞应激损伤。足细胞作为肾脏具有胰岛素敏感性的主要细胞，若足细胞出现IR，大量糖脂沉积于胞内，足细胞受损，肾小球滤过膜通透性降低，糖尿病向DN进展。Welsh等[6]剔除小鼠胰岛素受體后发现，即使小鼠外周血糖值正常时仍可出现蛋白尿，而肾组织活检则出现足细胞凋亡等一些DN的特征。因此，IR在加速DN的发生、发展中所发挥的消极作用不容忽视。 1.2 氧化应激 氧化应激是机体氧化物质的产生大于清除，从而造成组织细胞氧化损伤的一种应激状态。研究认为，由于高程度的氧化应激，高血糖可能是足细胞损伤的关键。足细胞对氧化应激反应高敏感，是由于其需要消耗大量的ATP以维持多级足突结构能正常附着于GBM上。在高糖环境中，糖氧化激增，产生过多的不稳定的活性氧簇（ROS）结合体内的蛋白质、脂类等，激活多条氧化途径，导致肾脏损害。Susztak等[7]研究发现ROS具有多种作用，①直接损伤足细胞;②激活足细胞NADPH氧化酶、p38MAPK和caspase-3途径，生成大量ROS，诱导足细胞的凋亡;③影响足细胞的信号传递致足细胞凋亡。Zhou等[8]通过体内和体外实验发现终末氧化蛋白产物（AOPPs）的积累也可通过NADPH氧化酶导致体内ROS增多，激活caspase-3，最终尿蛋白增多、足细胞凋亡。ERS是另一种氧化应激，内质网腔中折叠错误及未折叠蛋白积聚等均可损伤内质网功能，继而促发ERS。持续高强度的ERS将激活PERK/ATF6/IRE1通路，CHOP蛋白高表达，足细胞应激损伤。GRP78是内质网蛋白之一，能反映细胞内是否发生ERS。我国学者用低剂量的AGEs孵育足细胞24 h，观察到GRP78表达上调，触发ERS，最终足细胞凋亡;用高剂量的AOPPs孵育足细胞24 h后，足细胞CHOP蛋白高表达，使用ERS抑制剂预处理可使部分CHOP的mRNA低表达，而使用ERS激活剂预处理则可产生同AOPPs孵育后的结果;证实了AGEs和AOPPs介导了氧化应激和ERS诱导的足细胞凋亡[9]。因此，我们认为，氧化应激与ERS相互作用，最终引起足细胞损害与凋亡。 1.3 炎症因子 DN早期足细胞脱落、数量减少，细胞骨架、细胞表面屏障分子表型改变及功能失衡都有炎症信号通路参与。如TNF-α、MCP-1等炎症因子可引起足细胞Nephrin蛋白表达下降，细胞外向细胞内骨架蛋白传递信号受阻，骨架蛋白排列紊乱，足细胞的正常结构遭到破坏，与GMB的黏附作用减弱从而剥离、脱落，肾小球滤过率下降，最终产生大量蛋白尿[10]。MCP-1是对单核细胞最强的趋化因子，研究发现人足细胞通过促进MCP-1与CCR2结合使单核细胞浸润增多，下调Nephrin的表达。MCP-1及CCR2在DM模型的小鼠肾小球中高表达，MCP-1的表达与Nephrin、Synaptopodin骨架蛋白表达呈负相关[11]。AGEs与RAGE结合后，激活的RAGE作为信号传导受体激活肾脏细胞中的第二信使，如核转录调控因子NF-κB等，其被激活后，在细胞核内与多种基因启动子特异性序列结合，引起IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子、生长因子、黏附分子等表达和释放，从而导致炎症反应增强，纤维化相关的细胞因子及表达因子的增多等。这些细胞因子可使ROS生成增多，与血管内皮细胞的损伤、各种组织细胞的凋亡等多个病理生理过程相关。一项关于肿瘤坏死因子受体TNFR与糖尿病肾病关系的研究发现，肾小球足细胞上存在着TNFR1/2表达，且表达程度与尿蛋白水平具有正相关性，提示TNF-α可以通过与TNFR1/2结合活化NF-κB，激活的NF-κB进入细胞核内与凋亡相关基因（c-myc）共同操控足细胞Nephrin基因表达[12]。因此，越来越多学者认为，在足细胞凋亡的进程中，炎症因子和免疫损伤起着主导的作用。 1.4 自噬功能失调 自噬是真核生物内一种保守的控制细胞蛋白或细胞器降解过程的细胞途径。随着自噬研究的深入，学者们发现正常的足细胞内也保持着较高的自噬水平，以维持足细胞结构、功能的稳定性，在DN病理条件下，足细胞的自噬水平受到抑制，足细胞稳态被破坏。Tagawa等[13]特异性敲除小鼠足细胞自噬相关基因ATG5/ATG7基因后以高脂饮食喂养，发现2个月内小鼠表现出轻度肾小球损伤，6个月后出现肾衰竭;超微结构发现足细胞中有异常形态的溶酶体大量累积。此外，用患有糖尿病和大量蛋白尿患者的血清刺激培养的足细胞会损害自噬，溶酶体功能障碍，导致足细胞凋亡。这些结果首次表明自噬参与了DN的发病机制，其在维持糖尿病状态下足细胞的溶酶体稳态中起着关键作用，自噬功能的损伤导致足细胞的丢失。目前已知细胞主要通过雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路和AMPK信号通路调控自噬。Cinà等[14]在人体外足细胞使用mTOR抑制剂后，发现自噬体标记蛋白LC3、自噬体、自噬细胞及受损线粒体大量沉积在细胞浆内，表明mTOR活性过度降低可损伤足细胞。然而，在人和小鼠DN模型中均发现，mTOR活性过度激活也伴有足细胞损伤[15]。在STZ诱导的DN小鼠中，AMPK磷酸化的活性降低，从而抑制自噬启动蛋白ULK1复合物的形成与活性;而给予STZ小鼠注射AMPK信号通路的激活剂后，激活的细胞自噬功能可减轻足细胞损伤，降低蛋白尿，保护肾功能。可见，mTOR及AMPK保持一定活性，自噬水平保持平衡，对保护足细胞，延缓DN患者病情进展尤为关键。 1.5 转化生长因子（TGP-β1） 各项研究均证实，TGP-β1是介导足细胞凋亡的重要因子，其作用机制包括直接损伤、诱导凋亡及上皮-间质转分化（EMT）。有学者发现TGF-β1和Smad7在促使足细胞发生凋亡时相互间具有协同效应，TGF-β1通过激活p38MAPK、caspase-3诱导细胞凋亡，而Smad7则通过抑制核转录因子、NF-κB来达到协同效应;p38MAPK还可上调caspase-3表达，共同诱导足细胞凋亡，而使用p38MAPK抑制剂可减轻上述效应[16]。α3β1整合素使足细胞能黏附在GBM上，α3β1整联蛋白介导细胞黏附和整合素信号传导以维持肾小球滤过屏障。研究者证实TGF-β1抑制足细胞α3β1整合素的表达，从而减弱足细胞在GBM的黏附，最终直接损伤足细胞[17]。目前已知诱导足细胞发生EMT重要的介质之一是TGF-β。足细胞EMT是由于上皮细胞分子Nephrin、Podocin等表达丢失，转而表达间充质细胞分子Desmin、Snail等，肾脏逐渐纤维化。已知足细胞EMT的信号调控途径主要包括TGF-β/Smads通路、Wnt/β-catenin通路、ILK通路、丝裂原激活蛋白酶（MAPKs）通路、Jagged/Notch通路以及核因子NF-κB通路等。近年来许多学者试图运用中药调控足细胞EMT的信号通路或其关键因子，从而减轻蛋白尿，维持足细胞生理结构的完整性。 2 中药治疗DN研究进展 DN归于中医“消渴病”中的“下消”，中药在防治DN方面有丰富的理论和实践经验，且中药不同于西药的靶点单一，副作用明显，具有多环节、多靶点、毒副作用小等优势。近年研究的代表性中药有效成分包括三七总皂苷（PNS）、雷公藤多苷（TW）、黄芪多糖（APS）、白芍总苷（TGP）等。 2.1 三七总皂苷 PNS提取于三七，具有抗炎、抗氧化应激等作用。研究表明，DM小鼠足细胞病变表现为WT-1标记的足细胞数目减少和Nephrin蛋白表达降低。此外，与正常小鼠相比，KK-Ay小鼠中α3整合素和β1整合素的表达较低。α3β1整合素的低表达导致足突脱落，足细胞和GBM锚定丧失。进一步的研究观察到PNS通过调节Nephrin和α3β1整合素，起到降低糖尿病小鼠的血糖、肾脏重量和蛋白尿的作用，通过恢复足细胞标志物WT-1和增加Kph-Ay小鼠中的Nephrin的表达，可改善肾小球滤过屏障和减轻足细胞病变[18]。李敬华等[19]分别用PNS、ACEI对DN大鼠进行干预，实验结果发现，PNS组和ACEI组大鼠血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）及24 h尿蛋白水平较模型组明显降低，肾脏AGEs水平明显下调，PNS组与ACEI组上述指标比较差异均无统计学意义，证实PNS可对抗高糖环境下高氧化应激状态、抑制AGEs过度生成，以保护足细胞、减轻肾损害。 2.2 雷公藤多苷 TW提取于雷公藤，具有抗炎、调节免疫等作用。体内外实验证实，TW具有以下功能：①减少炎性因子释放以减轻DN患者蛋白尿，保护受损足细胞;②恢复足细胞骨架结构以及分子表达，抑制足细胞凋亡;③阻断TGP-β通路，抑制肾组织纤维化。凌厉等人[20]使用TW干预DN大鼠模型12周后，观察到TW治疗能明显减轻大鼠肾脏足细胞病变，Nephrin蛋白表达上调，推测TW可能通过上调Nephrin蛋白的表达来减轻DN足细胞损害。葛永纯等[21]选取了65例符合DN诊断的患者进行前瞻性随机对照临床试验，将患者随机分為TW组和ARB组，观察到达治疗终点6个月后两组尿蛋白水平及肾功能改善情况，结果显示TW组尿蛋白较基线明显下降，且起效迅速;ARB组血SCr较TW组明显升高，而GFR下降明显，不良反应发生率两组间差异不显著。证实TW能够有效减少DN患者蛋白尿，改善肾功能，疗效优于ARB，且安全性好。 2.3 黄芪多糖 APS提取于黄芪，具有降糖、抗炎、调节免疫等作用。有研究者利用司氏归纳法统计分析多个治疗糖尿病的方剂，发现药物应用次数最多是黄芪。李志杰等[22]对DN大鼠应用APS干预后，大鼠BUN、 SCr和血糖值均得到改善，Nephrin、Podocin表达部分恢复，推测APS通过维持Nephrin和Podocin蛋白的稳定表达，保护足细胞，减轻DN肾脏病理改变。我国学者观察高糖联合APS培养足细胞，发现APS可能通过上调α3β1整合素表达水平，达到改善足细胞黏附能力，具有保护因高糖受损的足细胞，防治DN蛋白尿的作用[23]。临床试验表明，对老年早期DN患者应用APS注射液干预治疗3周后，早期活化T淋巴细胞、炎症因子TNF-α及IL-6均显著低于治疗前及对照组，提示APS有可能通过调节免疫功能、减少炎症反应以改善患者肾功能[24]。 2.4 白芍总苷 TGP提取于白芍，具有抗炎、抗氧化应激、调节免疫等作用。研究发现DN患者肾小球足细胞中Nephrin、Podocin蛋白表达与尿蛋白呈负相关[25]。张培等人[26]予DM大鼠TGP治疗8周后，大鼠24 h尿白蛋白排泄率明显下降，Nephrin的表达部分恢复，TNF-α与NF-κB蛋白的表达呈剂量依赖性的降低，因此推测TGP减轻蛋白尿的机制可能与其抑制NF-κB活性，下调TNF-α表达，上调足细胞Nephrin表达有关。临床试验表明，予确诊DN患者在综合治疗的基础上口服TGP，3个月、6个月时患者24 h尿蛋白定量较治疗前及仅采用综合治疗的患者明显降低[27]。Zhu等[28]选取了76例DN患者进行前瞻性随机对照临床试验，将患者随机分为TGP组及ARB组，观察两组到达治疗终点6个月后尿白蛋白排泄率及炎性标志物下降情况，结果显示TGP组尿白蛋白排泄率的下降率明显高于ARB组，且血清hs-CRP、MCP-1和TNF-α下降幅度大于ARB组，表明TGP可以降低DN患者的蛋白尿和炎症标志物。可见，TGP在DN治疗中取得了与上述中药相似的治疗效果，由此推测，TGP可能也具有作用于DN足细胞的保护作用，但鲜有文献报道，值得进一步研究。 3 小结 近年来，糖尿病肾病足细胞损伤机制的研究侧重于自噬功能失调及炎症因子损伤。许多研究均表明中药有效成分能有效减轻DN患者蛋白尿，延缓肾衰竭，但其主要作用通路及机制尚未明确。以白芍总苷为例，目前仅能观察到TGP能有效降低蛋白尿、减轻DN炎症反应、改善肾功能，但尚无确切证据说明TGP是否通过抑制足细胞MCP-1、TNF-α表达，进而上调Nephrin、Podocin表达来抑制炎症反应、改善蛋白尿、延缓肾功能恶化，因此进一步研究TGP在机体内作用于DN的机制有重要意义。 参 考 文 献 [1]顾天菊，王清.糖基化终末产物与糖尿病肾病关系的研究进展[J].中国实验诊断学，2017，21（2）：364-367. 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