| 标题 | 锁核酸在肝癌的基因诊断与治疗研究新进展 |
| 范文 | 彭彬 邓益斌 【摘要】锁核酸（locked nucleic acid，LNA）是一种新颖的核苷酸衍生物，其作为一种反义治疗药物在分子生物学研究领域引起了广泛关注，有希望成为治疗各种疾病和肿瘤的新突破口。目前，LNA技术是分子生物学领域开展较为成熟的技术之一，因LNA具有极强的抗核酸酶能力、反义活性、水溶性好及体内无毒性等优点而倍受人们关注，特别在与DNA、RNA杂交具有强大的亲和力展现出令人鼓舞的前景。然而，LNA技术在肝癌的基因诊断与治疗研究领域仍然处于探索阶段，综述国内外有关LNA技术在肝癌的基因诊断与治疗领域的应用研究及其进展，总结LNA的结构、在肝癌的基因诊断与治疗研究领域的应用现状、存在的问题及前景，有望为进一步深入研究LNA技术在其他领域的应用提供参考。 【关键词】锁核酸;肝癌;基因诊断;基因治疗 中图分类号：R735.7?文献标志码：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.12.001 【Abstract】Locked nucleic acid（LNA） is a novel nucleotide derivative.As an antisense therapeutic drug，it has attracted wide attention in the field of molecular biology and expected to become a new breakthrough for the treatment of various diseases and tumors.At present，LNA technology is one of the more mature technologies in the field of molecular biology.Because of its strong antinuclease ability，antisense activity，good water solubility，and non-toxicity in vivo，LNA technology has attracted much attention.Especially in hybridization with DNA and RNA，it has shown promising prospects.However，LNA technology is still in the exploratory stage in the field of gene diagnosis and treatment of liver cancer.Through summarizing the domestic and foreign applied research and the progress of LNA technology in the field of gene diagnosis and treatment of liver cancer，the structure of LNA，its application status，existing problems and prospects in the field of gene diagnosis and therapeutic research for liver cancer，this paper may provide references for further in-depth study of LNA technology for other fields. 【Key words】locked nucleic acid;liver cancer;gene diagnosis;gene therapy 1994年，Rodriguez等在发酵副产物中发现锁核酸（laked nucleic acid，LNA）。四年后，Kumar等[1]对LNA进行了第一次合成与杂交试验，随后，Wang等[2～3]进一步报道了LNA相关结构与性能的实验。LNA的产生给生物学技术及基因的诊断与治疗领域带来了进一步的发展和突破，更有利于人们研究各种由于基因缺失或异常所引起的疾病，对研究先天性疾病或肿瘤也具有重要的意义，并且使某些现阶段无法治愈的疾病在基因水平基础上可在未来实现完全治愈的可能。因此，笔者对LNA的结构、安全性和在肝癌的基因诊断与治疗进展进行综述，以期为LNA技术应用研究提供参考。 1?锁核酸结构 LNA是近几年核酸研究领域的新热点，又称为桥核酸，是一种特殊的双环状核苷酸衍生物，结构中含有一个或多个2-O，4-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖中的2-O位和4-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，并增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。LNA稳定性不仅体现在本身的结构上，在与其他物质相结合的时候，可以在一定程度上增加两者复合物的稳定性。Pabon等[4]报道，LNA与c-myc基因或共济蛋白（Frataxin）序列相结合时，随着LNA所取代的位置和数目出现不同的变化：当 LNA占两者复合物的比例较低时，复合物的三链体结构不稳定，而在三链形成的3末端的LNA含量升高，三链体形成速率和延伸可以得到提升，所形成的复合物的三链结构极其稳定。此外，LNA取代的双链嘧啶链中改变了双螺旋结构，其通过主沟槽调节影响了复合体空间结构，有利于形成三角形结构，从而使复合物更加稳定。 在20世纪90年代末，研究人员常用三唑键取代磷酸键的寡核苷酸以进行下一步实验，但是这种寡核苷酸在体内的抗核酸酶能力尚不理想，LNA是近些年核酸研究領域的新热点，与其他核苷酸类似物相比，LNA与DNA、RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故对DNA、RNA具有很好的识别能力和亲和力。因此，有人尝试将两个寡核苷酸组合在一起，以创造一个既稳定又成熟的寡核苷酸。Kumar等[5]报道三唑键取代磷酸键的寡核苷酸与LNA组合在一起形成新寡核苷酸时，在与RNA、DNA结合的过程中，发现新寡核苷酸展现出更高的特异性和更强的亲和力，并且明显优于仅含有三唑键取代磷酸键的寡核苷酸或LNA，这是因为三唑键取代磷酸键的寡核苷酸与LNA的组合可能改变了空间构象，使得此复合物与DNA、RNA的结合能够降低DNA、RNA的阴离子，且更具有亲和力和稳定性。不仅如此，与单独的三唑键取代磷酸键的寡核苷酸或LNA相对比，此复合物对核酸酶的酶解作用具有更强的抗性，并已证实此复合物对30种核酸外切酶也同样具备很强的抗性，因此，此复合物在治疗药物中的适当比例可以大大提高药物在体内稳定性[6]。与此同时，Sharma等[7]合成并研究了三唑连接的、LNA修饰的二核苷酸特性，并将它们结合到反义寡核苷酸和双链的siRNA中，他们发现此二核苷酸在寡核苷酸的3或5末端掺入时产生高结合亲和力，具有高活性和核酸酶抗性，其中已知的螺旋结构更具有灵活性，并且令人惊讶的是，含有三唑二聚体修饰的siRNA是该系列中最活跃的siRNA。 值得一提的是，经过科研工作者多年的努力和分子生物学等技术的发展与进步，不断有人报道基于LNA更好的寡核苷酸，如Morita等[8]提出，与LNA相比，在核糖的2-O和4-C之间具有乙烯桥的2-O，4-C-乙烯桥联核酸（ENA）除了具备LNA一样高的互补DNA、RNA结合力之外，还具有更高的核酸酶抗性，说明了这是一个具有良好前景的反义治疗物，具有重大的研究价值。 2?LNA技术治疗的安全性 在肝癌的基因治疗过程中，人们最关心的是LNA技术是否会对肝脏带来毒性损害。Guérard等[9]用小鼠淋巴瘤试验和微核试验评估了LNA在小鼠淋巴瘤细胞中诱导DNA损伤的潜力。所有的实验都没有证明被测试的LNA具有基因毒性效应。与此同时，在标准基因毒性体内与体外试验中测试的数据也均为阴性。Dieckmann等[10]利用体外方法转染小鼠成纤维细胞来预测LNA修饰的不同Tm值寡核苷酸的肝毒性。研究结果表明，LNA修饰的不同Tm值寡核苷酸所引起的肝毒性在小鼠成纤维细胞中也明显不同，这结果可能对人体也具有同样的作用。此外还发现，LNA修饰的寡核苷酸的Tm值维持在55℃的阈值水平以下时，肝毒性大大降低。 3?LNA在肝癌的基因诊断 肝癌分为原发性肝癌和继发性肝癌两大类，原发性肝癌是指起源于肝脏的上皮组织或间叶组织的恶性肿瘤，我国主要以原发性肝癌为主，对我国居民生命健康危害极大;继发性肝癌是指其他器官起源的恶性肿瘤转移或侵犯至肝脏所引发的癌症，一般以胃、胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移多见。目前，全球每年肝癌发病人数在100万以上，居世界第六位，死亡率居世界第二位，其中我国肝癌发病率为42.5%，新发病例和死亡病例中有一半以上发生在中国[11]。截止2015年，我国肝癌发病466 000余人，位列我国所有恶性肿瘤的第4位，死亡率为20.4/10 万，占我国全部恶性肿瘤死亡的18.8%，位列所有恶性肿瘤的第3位[12]。在中国所有癌症中，肝癌的存活率最低，5年相对存活率仅为10.1%[13]。与其他恶性肿瘤相同，肝癌的发生由多基因参与的、复杂的病理生理过程，而非编码RNA（Non-coding RNA）在肝癌的发展、转移等方面起着至关重要的作用，可作为肝癌诊断标志[14]。基因诊断技术，又称分子诊断技术，是指以双链DNA以及单链RNA为诊断材料，通过检测体内基因的存在、丢失或表达异常，对疾病做出诊断的生物学方法。锁核酸基因诊断技术能在许多疾病做出早期诊断，在肝癌的基因诊断中也具有重要的价值。Gougelet等[15]在体内实验和肝癌患者中发现，miR-34a与β-catenin蛋白有相关性，即随着β-连环蛋白过度活化，miR-34a的显著表达，通过LNA抑制miR-34a后发现肝细胞的原代培养物增殖活性显著下降，因此，miR-34a在具有β-连环蛋白基因突变的肝脏肿瘤中起到关键致癌作用，可作为早期的诊断指标。 大多数原发性肝癌与慢性乙型肝炎病毒感染有关，通过LNA基因诊断技术检测乙肝病毒患者体内的基因差异表达，可在早期阻断乙肝病毒的感染，进而避免发展为肝癌。Wang等[16]通過使用LNA探针修饰的microRNA芯片以检测慢性乙型肝炎的miR-122表达，通过与健康患者对比，miR-122在慢性乙型肝炎患者的血清中含量显著增高，由此可知，血清miR-122水平可能是慢性乙型肝炎患者早期诊断和恢复预后的潜在生物标志物。 4?LNA在肝癌的基因治疗 基因治疗技术，就是指通过基因转移和调控等手段，将正常基因转入出现基因缺陷的患者体内，进而取代致病的异常基因，或者通过基因编辑、调控、抑制等手段，针对异常的基因进行关闭，从而达到治疗因基因缺陷、丢失等引起的先天性遗传病、肿瘤、癌症的目的。LNA在基因治疗上具有更显而易见的特点[17]：（1）LNA单体结合到寡核苷酸链中可提高解链温度，每引入一个LNA单体，即可使解链温度提高3℃，其与DNA、RNA互补成为双链时提供很强的热稳定性;（2）抗酶解能力强，LNA具有特殊的结构而具有抗3脱氧核苷酸酶降解的能力，保护LNA结合物不受到降解;（3）LNA与DNA、RNA的结合可以对目的基因进行调控或者抑制，同时又可以被Rnase H识别从而对mRNA进行降解;（4）LNA在与DNA、RNA结合时，具有出色的错配辨别力;（5）LNA本身水溶性较好，可以自由出入细胞，易被机体吸收;（6）LNA单体半衰期长，如引入一个LNA单体到寡核苷酸中，此寡核苷酸在体内的半衰期至少可提高10倍。因此，通过LNA技术结合分子生物学等方法治疗基因异常所产生的问题，具有很好的应用前景。 4.1?LNA技术在肝癌治疗的体外研究 体外研究实验是指在体外使用从其通常的生物学环境中分离的生物体组分进行研究，例如微生物、细胞或生物分子。近年来，LNA在肝癌治疗的体外研究报道较少，主要集中在mircoRNA研究和mRNA反义寡核苷酸上。 4.1.1?mircoRNA LNA技术在mircoRNA检测和功能性研究中，比其他寡核酸修饰的探针更具有优势。在设计并合成mircoRNA探针时，随着LNA单体含量的增高，探针越稳定，再添加30%左右即可达到最佳效果。一般来说，DNA探针在与mircoRNA结合时，其双股构型会于A-type与B-type之间交替转换，导致不稳定;但LNA修饰的寡核苷酸探针能与mircoRNA配对结合后以更高的亲和力形成稳定的双股结构，Tm值也因为LNA的加入而提高，使探针能够有效且稳定地对mircoRNA进行检测和功能性分析。Najafi等[18]通过使用经过LNATM修饰的探针以抑制microRNA-23b在HepG2细胞内的表达，在与未经处理的细胞为参考对照，microRNA-23b的抑制在24小时后降低了HepG2细胞的侵袭行为，在72小时后作用更为明显。 4.1.2?mRNA反义寡核苷酸 mRNA反义寡核苷酸主要的技术原理是与mRNA某一区段互补的核酸片断，可以通过碱基互补原则结合于靶基因/mRNA上，从而封闭基因的表达。Javanbakht等[19]报道使用一种LNA修饰的寡核苷酸可以在较长的时间内有效降低HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg的表达，平均有效浓度为1.19～1.66 mm。为了增强此寡核苷酸对肝细胞表达靶点的活性，通过连接到一个N-乙酰半乳糖胺簇以实现对肝细胞的优先传递，该簇通过肝细胞特异性去唾液酸糖蛋白受体来引导摄取。值得注意的是，以较高剂量的N-乙酰半乳糖胺簇结合的寡核苷酸可导致HBsAg快速、持久地降低到低于定量检测限。肖树荣等[20]设计并合成能特异性封闭增殖相关基因 （C-myc） mRNA 第二外显子翻译起始区的反义寡核苷酸、硫代寡核苷酸和LNA，分别以阳离子半乳糖配体介导转染 HepG2 细胞，在转染第5天后，LNA组 C-myc mRNA相对表达量为0.335， 明显低于对照组的1.014，C-myc 蛋白相对表达量为0.448 ，也明显低于对照组的1.00，细胞凋亡比例为32%，显著高于对照组，因此，针对 C-myc 第二外显子翻译起始区的LNA能有效抑制肝癌细胞增殖和促进细胞凋亡。 4.2?LNA在肝癌病毒治疗的体内研究 Delgado等[21]研究了LNA对β-连环蛋白抑制的影响。结果表明，与对照组相比，在每48小时用LNA对小鼠肿瘤模型的β-连环蛋白进行10次治疗后，观察到肝细胞癌被完全治愈。在β-连环蛋白抑制后，其活性显著降低，细胞增殖和细胞死亡增加明显。说明LNA可以通过抑制肝细胞癌中β-连环蛋白以达到治疗目的。Xiao等[22]观察LNA在转基因小鼠体内的抗病毒作用。结果发现，在治疗后第3、5、7天，HBV DNA显著抑制，并且在抗基因LNA组中，HBV S基因的相对mRNA表达为0.33，HBsAg阳性肝细胞的百分比为31%，与对照组中的这两个指标对比差异有统计学意义。邓益斌等[23]针对前C、C基因翻译起始位点分别设计合成反义LNA 序列，通过带正电荷的阳离子脂质体与带负电荷的LNA 序列的静电作用形成缀合物，并利用脂质体的亲脂性将LNA 序列送入肝细胞，识别并结合到乙肝病毒前 C、C基因的mRNA 单链上，形成 LNA/mRNA 杂交双链分子，以阻断 mRNA 的翻译，发挥抗病毒作用。研究结果表明，反义LNA给药后，无论是单靶区组还是双靶区组，乙肝病毒 DNA复制、乙肝病毒 C 基因mRNA 表达、乙肝病毒表面抗原及核心抗原合成等指标均明显下降，且封闭双基因位点对病毒复制的影响更为明显。给药后5天，双靶区前C/C组的乙肝病毒DNA 复制和乙肝病毒表面抗原合成的平均下降率分别为53.72%和71.57%;乙肝病毒C基因 mRNA 的表达与乙肝病毒核心抗原合成均明显下降。 5?不足与展望 随着分子生物学技术的不断发展以及研究人员对LNA研究的不断深入，LNA技术已广泛应用于miRNA研究、SNP基因分型、mRNA反义寡核苷酸、等位基因特异性PCR、RNA干扰、DNAzymes、荧光偏振探针、分子信标、微阵列基因表达谱分析、基因修复与外显子跳躍、拼接变异检测、比较基因组杂交等领域，同时，LNA已经成功用于克服研究非常短的序列的困难，已经极大地改进，在许多情况下能够特异性和灵敏地检测非编码核糖核酸及其他小核糖核酸分子，并且LNA寡核苷酸区分高度相似序列的独特能力已在许多针对较长核糖核酸序列（如核糖核酸）的应用中得到进一步开发。此外，LNA已成功用于低丰度核酸和染色体脱氧核糖核酸的检测，在诸多疾病中如胃癌、肺癌、乳腺癌等均有相关报道，但是目前针对肝癌的报道尚少，主要原因有以下几点：（1）肝癌是一个多基因共同缺陷或异常引起的疾病，单基因缺陷或异常引发的肝癌很少，因此，LNA抑制单基因位点以治疗肝癌的可行性尚需大量实验证明。（2）LNA修饰的寡核苷酸在体内产生的肝毒性仍需降低以避免其他问题产生。（3）从伦理学角度来看，LNA基因治疗应用到人体身上仍需长时间摸索。随着基因编辑等新兴技术的崛起，LNA技术研究的不断成熟，相信会有更多更好的研究成果展现出来，从而为攻克肝癌做出贡献。 参?考?文?献 [1]Kumar R，Singh SK，Koshkin AA，et al.The first analogues of LNA（locked nucleic acids）：phosphorothioate-LNA and 2'-thio-LNA[J].Bioorg Med Chem Lett，1998，8（16）：2219-2222. 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