| 标题 | 用于检测Al3+和pH值的双功能荧光分子探针 |
| 范文 | 李静+韩书华 摘要利用荧光素（Fluorescein）对罗丹明6G（Rhodamine 6G）进行修饰，得到荧光分子探针R6GFlu杂化物。此探针可特异性识别Al3+，检出限可低至10 Symbolm@@ 8 mol/L级； 向含有探针分子的溶液中加入Al3+后，溶液的颜色由无色变为粉色，并且在紫外灯下发出绿色荧光，可实现肉眼对10 μmol/L Al3+的定性检测。考察了不同pH值下R6GFlu的荧光性质。 结果表明，此探针还可用于酸性范围（pH 3.00～6.00）和碱性范围（pH 8.00～10.50）内pH值的精确检测。实验结果表明，R6GFlu是一种可用于Al3+和pH值检测的双功能荧光分子探针。 关键词双功能； 荧光分子探针； pH值检测； Al3+； 罗丹明衍生物 1引 言 目前使用的荧光分子探针，能够实时、原位地检测对环境和生命过程有重要作用的pH值、分子和离子等，并且已经广泛应用于溶液环境下的检测和细胞成像等领域[1～3]。荧光分子探针通过特异性识别微观环境中的目标检测物，具有选择性高、灵敏度高和检出限低等特点[4，5]。罗丹明染料的光物理性质优良，量子产率高，光稳定性强，易于被修饰，得到对金属离子有选择性响应的荧光分子探针[6～8]。罗丹明衍生物传感机理是被分析物质能够引起其中的螺环结构发生“关开”转变，相应地荧光发生“关开”的变化。螺环形式的探针溶液为无色溶液，无荧光发射； 开环形式的探针溶液变为有色溶液，并且有较强的荧光发射，因此罗丹明衍生物可分别通过溶液颜色的改变和荧光发射光谱的测定，实现对某特定物质的肉眼定性检测和定量检测。 罗丹明衍生物对环境pH值的改变有灵敏的响应。在碱性条件下，它保持螺环形式，无荧光发射； 但在酸性环境中有较强的荧光发射[9，10]。相反，荧光素（Fluorescein）在碱性条件下保持开环形式，发出荧光； 但在酸性条件下螺环关闭，无荧光发射[11，12]。本研究根据二者对pH值的敏感特性，以及罗丹明衍生物可用于金属离子检测的性质[13～15]，利用荧光素对罗丹明6G（Rhodamine 6G）进行修饰，得到一种新型荧光分子探针R6GFlu杂化物。此荧光分子探针中含有两个内酰胺的螺环结构，分别对应二者的荧光分子结构。它既可用于环境pH值的响应，还可用于Al3+的传感，与文献[13～15]报导的方法相比，R6GFlu对Al3+的選择性更高，检出限更低。 2实验部分 2.1仪器与试剂 AVANCE300核磁共振波谱仪（300 M， 瑞士Bruker公司）； U4100紫外可见近红外分光光度计（日本Hitachi公司）； LS55荧光磷光发光分光光度计（美国PerkinElmer公司）； PHS3C pH计（上海雷磁仪器厂）。 罗丹明6G（日本TCI公司）； 水合肼（80%）、NaOH（分析纯）（天津登科化学试剂有限公司）； 乙二醛（40 wt%水溶液，阿拉丁）； 荧光素（90%，分析纯，阿拉丁）； 乙腈（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）； 乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、冰乙酸（分析纯，天津市富宇精细化工有限公司）； 磷酸（分析纯，莱阳市康德化工有限公司）； 硼酸（分析纯，天津市赢达稀贵化学试剂厂）。金属离子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Ni2+、Cu2+、Pb2+、Cd2+、Co2+、Hg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cr3+、Al3+）的原液0.01 mol/L）采用其相应的氯盐进行配制，Ag+（0.01 mol/L）原液采用AgNO3配制。BrittonRobinson缓冲溶液由磷酸、硼酸和冰乙酸配制，并用NaOH（0.2 mol/L）溶液在酸度计上调至所需pH值。所有试剂未进一步纯化，直接使用。 2.2化合物的合成与表征 荧光分子探针R6GFlu的合成路线如图1所示。其中所有化合物的鉴定均通过1H NMR进行了表征判断。 2.2.1化合物1的合成与表征化合物1的合成与文献[16]报道的方法相同。将罗丹明6G（9.58 g， 0.02 mol）溶解于300 mL乙醇中； 室温下充分搅拌。将37 mL水合肼（0.76 mol）逐滴滴加到上述溶液中，滴加完毕后升温至80℃回流。2 h后，溶液中罗丹明6G的荧光消失。冷却，过滤，所得固体用乙醇洗涤数次。干燥， 得到粉色固体7.06 g（产率82.0%）。1H NMR表征结果：δH（300 MHz，DMSOd6， Me4Si） 1.20（6H，t，CH3）； 1.87（6H，s，ArCH3）； 3.08～3.17（4H，m，ArNHCH2）； 4.22（2H，s，NH2）； 5.00（2H，t，ArNH）； 6.09（2H，s，ArH）； 6.26（2H，s，ArH）； 6.91～6.94（1H，m，ArH）； 7.44～7.47（2H，m，ArH）； 7.74～7.77（1H，m，ArH）。 2.2.2化合物2的合成与表征将化合物1（3.00 g，6.99 mmol）溶解于乙醇/二氯甲烷（2∶3，V/V）混合溶剂中。在N2氛围下，将上述溶液逐滴滴加于乙二醛（19.86 mL，174.75 mmol）的乙醇溶液中（浓度为2.92 mol/L），在室温下反应12 h。反应完毕后， 减压旋蒸， 除去大部分溶剂，剩余少量溶剂，加入30 mL乙醇，即析出大量黄色固体。过滤，使用乙醇充分洗涤，干燥后得到黄色固体2.63 g（产率80.2%）。1H NMR表征结果： δH（300 MHz，DMSOd6，Me4Si）1.20（6H，t，CH3）； 1.85（6H，s，ArCH3）； 3.09～3.18（4H，m，ArNHCH2）； 5.16（2H，t，ArNH）； 6.18（2H，s，ArH）； 6.31（2H，s，ArH）； 7.02～7.04（1H，d，ArH）； 7.28～7.28（1H，d，ArH）； 7.57～7.69（2H，m，ArH）； 7.98～8.00（1H，d，NCH）； 9.23～9.26（1H，d，CHO）。δH 4.22（NH2）处峰的消失和δH 7.98（NCH）与δH 9.23（CHO）处峰的出现，表明化合物2被成功合成。 2.2.3化合物3的合成与表征化合物3的合成采用文献[17]报道的方法。将荧光素（7.00 g，18.95 mmol）分散于300 mL乙醇中，得到橙色悬浊液。向上述悬浊液中加入过量水合肼（37 mL，0.76 mol），加热回流12 h，随着反应的进行，悬浮颗粒逐渐消失，最终得到暗红色澄清透明溶液。减压旋蒸至剩余少许溶剂，加入200 mL去离子水，析出淡黄色固体，静置3 h后，过滤，用去离子水和乙醇交替洗涤数次，干燥后得到淡黄色粉末6.15 g（产率93.7%）。1H NMR表征结果：δH（300 MHz，DMSOd6，Me4Si）4.37（2H，s，NH2）； 6.38～6.47（4H，m，ArH）； 6.58～6.59（2H，d，ArH）； 6.97～7.00（1H，m， ArH）； 7.45～7.52（2H，m，ArH）； 7.76～7.79（1H，m，ArH）； 9.62（2H，s，ArOH）。 2.2.4荧光分子探针R6GFlu的合成与表征将化合物2（1.20 g，2.55 mmol）溶解于200 mL氯仿中，化合物3（1.04 g，3 mmol）溶解于100 mL乙醇中，二者混合，加热到80℃，回流12 h，反应结束后为橙色澄清透明溶液，减压旋蒸，剩少许溶剂时加入100 mL乙醇，析出橙黄色固体，过滤，滤饼用乙醇洗涤，直至滤液变为无色透明。干燥后得到橙色粉末1.59 g（产率78.0%）。1H NMR表征结果： δH（300 MHz， DMSOd6，Me4Si）1.17～1.24（6H，m，CH3）； 1.76～1.85（6H，m，ArCH3）； 3.09～3.18（4H，m，ArNHCH2）； 5.03～5.06（2H，t，ArNH）； 6.09（2H，s，ArH）； 6.30～6.31（2H，d，ArH）； 6.38～6.44（4H，m，ArH）； 6.64～6.65（2H，d，ArH）； 6.91～7.00（2H，m，ArH）； 7.47～7.60（4H，m，ArH）； 7.74～7.77（1H，m，NCH）； 7.87～7.90（3H，m，2ArH + NCH）； 9.95（1H，s，ArOH）。 2.3紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱的测定 2.3.1R6GFlu对金属离子选择响应性的探究R6GFlu母液（1 mmol/L）用乙腈配制； 向R6GFlu的乙腈溶液中分别加入不同的金属离子（Ag+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Zn2+、Ni2+、Cu2+、Pb2+、Cd2+、Co2+、Hg2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Cr3+和Al3+），R6GFlu和金属离子的最终浓度分别为1.0 μmol/L和10 μmol/L。放置2 h后进行测试，以保证探针分子和金属离子的充分络合。 2.3.2不同浓度Al3+存在下体系的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱的测定保持R6GFlu浓度为10 μmol/L， Al3+浓度从1.0 μmol/L增加到15 μmol/L。紫外可见吸收光谱的测试在光程为1 cm的石英比色池中进行； 荧光发射光谱的采集采用500 nm为激发波长，激发狭缝和发射狭缝分别为6.0 nm和2.5 nm。 2.3.3不同pH值下R6GFlu荧光发射光谱的测定配制BrittonRobinson缓冲溶液，用0.20 mol/L NaOH溶液調节溶液的pH值，使溶液的pH值在3.00～10.50之间，再向其中加入0.1 mmol/L R6GFlu。 2.4荧光分子探针R6GFlu对Al3+检出限的确定 检出限（Limit of detection，LOD）由公式（1）[18]计算求得： LOD=3σbim（1） 其中， σbi是空白溶液测量（即不加金属离子时）的标准偏差。m是信号强度与Al3+浓度（[Al3+]）线性关系图的斜率。在本实验中，测定了20个R6GFlu溶液的光谱，得到空白测量的标准偏差σbi； 根据2.3节所测定的不同浓度Al3+存在下体系的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱数据，作528 nm处吸光度和554 nm处荧光强度与[Al3+]的线性关系图，得到斜率m， 计算出检出限。 2.5结合常数的确定 Al3+与R6GFlu的结合常数通过BenesiHildebrand（BH）方程（2）[19]计算： 1F-F0=1{Ka×（Fmax-F0）×[Al3+]}（2） 其中， F为不同浓度Al3+存在下所测得的荧光强度，Fmax和F0分别为Al3+浓度最大和无Al3+时的荧光强度，[Al3+]为与F相对应的Al3+浓度，测试方法按照2.3节进行。 2.6Al3+与R6GFlu的配合物的摩尔吸光系数（ε）和荧光量子产率（）的确定 摩尔吸光系数根据朗伯比尔定律A=εbc确定，本实验A为528 nm处的吸光度，光程b为1 cm，c为Al3+R6GFlu配合物的浓度。 荧光量子产率由公式（3）确定[20，21]： x=n2xn2s·FxAsFsAx（3） 其中，、n、F和A分别为物质的荧光量子产率、所采用溶剂的折射率、最大吸收波长激发下测得的荧光积分面积和最大吸收波长处的吸光度； x为待测物， s为标准物。本实验中溶剂均采用乙醇； 标准物选用罗丹明B，s=0.89。 3结果与讨论 3.1荧光分子探针R6GFlu对金属离子的响应特性 3.1.1R6GFlu对Al3+选择响应性 首先研究了R6GFlu的光谱性质，如图2所示。R6GFlu在可见光区无吸收峰（图2A插图），也无荧光发射峰（图2B），说明此时它是以螺环形式存在。当加入不同金属离子后，Al3+会引起R6GFlu的光谱发生明显变化，528 nm处出现了的新吸收峰， 554 nm处出现荧光发射峰。Cr3+也可引起相似的光谱变化，但其变化程度远小于Al3+。其它金属离子均未引起光谱的显著变化，因此可以认为该探针能够优先识别Al3+。 向R6GFlu溶液中加入混合金屬离子（Al3+和另一种干扰离子）后，与仅含Al3+的体系相比，其吸收峰和荧光发射峰强度均没有显著的变化（相对误差分别为2.6%和1.6%），表明R6GFlu对其它的共存干扰离子有较好的耐受性。 3.1.2不同浓度Al3+存在下体系的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱不同浓度Al3+存在时体系的紫外可见吸收光谱如图3A插图所示，528 nm处的吸收峰可归属为Al3+与R6GFlu形成的配合物，在此配合物中，罗丹明部分螺环结构处于“开环”状态， 该吸收峰的强度随着Al3+浓度的增加而线性增强（图3A）。通过朗伯比尔定律可确定配合物溶液的摩尔吸光系数ε= 6180 m2/mol。 荧光发射光谱也表现出相似的变化趋势（图3B），随Al3+浓度的不断增加，554 nm处荧光发射峰持续增强。当加入15 μmol/L Al3+时，荧光强度值达到最大。此探针对Al3+的线性检测范围为1.0～15.0 μmol/L。 紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱空白测量的标准偏差分别为0.0017和0.2095。分别利用图3A和3B中线性关系图的斜率，根据公式（1）求得检出限分别为6.67×10 此外，当向10 μmol/L R6GFlu中加入等浓度Al3+后，溶液发生显著变化，由无色变为粉色，在紫外灯（365 nm）照射下，发出绿色荧光（图4）。此现象说明R6GFlu可用于低至10 μmol/L Al3+的肉眼识别。因此，R6GFlu可通过颜色和光谱双信号的改变，分别实现对Al3+的定性与定量的检测。 3.1.3R6GFlu与Al3+结合常数的确定根据BenesiHilderbrand （BH） 方程绘制工作曲线（见图5），由此可计算出R6GFlu和Al3+的结合常数K=2.81×104 L/mol。 3.2荧光分子探针R6GFlu对pH的响应性质 不同pH值下R6GFlu的荧光发射光谱如图6插图所示。在pH 3.00～6.00范围内， R6GFlu表现出罗丹明6G部分的荧光发射峰（541 nm），并且荧光强度随着pH值的降低而线性增强，在pH 8.00～10.50范围内，此分子呈现出荧光素部分的荧光发射峰（524 nm），其强度随着pH值的增加也呈线性增强。据此可绘制出pH 3.00～6.00和pH 8.00～10.50的工作曲线（图6），从而实现在相应范围内的pH值检测。R6GFlu 对pH值传感机理如图7所示，在酸性环境下，R6GFlu分子中的罗 丹明部分质子化造成螺环结构的开环； 在碱性条件下， 此分子的荧光素部分上的酚羟基的解离造成其螺环结构的开环。 4结 论 荧光分子探针R6GFlu可选择性识别Al3+，并且具有较低的检出限和良好的选择性，还可通过直观的溶液颜色改变实现对Al3+肉眼定性识别； 此探针对pH值具有高度敏感性，可对小范围变化的pH值进行精确测定。因此，R6GFlu是一种双功能的荧光分子探针，可以作为检测微环境中Al3+和pH值改变的有力工具。 References 1Wan Q Q， Song Y C， Li Z， Gao X H， Ma H M. 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Dalton Trans.， 2015， 44（26）： 11805-11810 Bifunctional Fluorescence Molecular Probes for Detection of Aluminum and pH LI Jing， HAN ShuHua* （School of Chemistry and Chemical Engineering， Shandong University， Jinan 250100， China） AbstractA fluorescent molecular probe R6GFlu was prepared by modifying fluorescein onto Rhodamine 6G. The probe could be used to recognize Al3+ specifically， and the detection limit could reach as low as 10-8 mol/L. After addition of Al3+ （10 μmol/L） to the probe， the solution showed a color change from colorless to pink， and green fluorescence was observed under the UV irradiation， which could be perceived by the naked eye. By measuring the fluorescence emission intensity of R6GFlu at different pH， the probe could also be used to determine pH in acidic pH range （3.00-6.00） and basic pH range （8.00-10.50）. The detection results of Al3+ and pH indicated that the R6GFlu was a dualfunctional fluorescent molecular probe. KeywordsBifunctional； Fluorescence molecular probe； pH detection； Aluminum； Rhodamine derivatives （Received 2 March 2017； accepted 23 June 2017） |
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