| 标题 | 介孔沸石材料负载传统基质用于激光解吸电离飞行时间质谱分析小分子化合物 |
| 范文 | 杨梦瑞+李鹏+王敏+周剑+刘芳+张丽媛 摘 要 考察了介孔沸石材料负载传统有机基质α氰基4羟基桂皮酸（CHCA）用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）分析多肽Substance P和氟喹诺酮类药物等小分子的效果。在相同的MALDITOFMS质谱条件下，与传统CHCA进行了比较，同时分别考察了不同硅铝比（SiO2/Al2O3）的ZSM5以及不同介孔大小的Beta与ZSM5沸石载体对Substance P的检测效果。结果表明，沸石负载CHCA新型复合基质具有抑制碱金属离子峰、消除干扰碎片离子、简化与改善质谱图、提高离子化效率等优点。 实验结果表明，沸石表面酸性越强，有力介孔能够充分包裹CHCA分子，则复合基质抑制干扰碎片和提高离子化效率的能力越高。复合基质成功应用于复杂样品中恩诺沙星与诺氟沙星药物小分子的MALDITOFMS检测。 1 引 言 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）具有高灵敏、高通量、不影响分子结构完整性等诸多优点[1]，在分析小分子物质的研究中应用广泛[2，3]。然而，由于传统的有机基质，如2，4，6三羟基苯乙酮（THAP）、α氰基4羟基桂皮酸（CHCA）等，分子量都约为200 Da，在激光的辐照下，将在小质量数的范围（< 500 Da）内产生大量的基质碎片，从而干扰小分子物质的检测[4]。为克服这一缺点，一些新型的无机材料[3， 5]、石墨烯[6]、金属有机化合物[7]、介孔材料[8]、纳米颗粒[9]等，被用于修饰或取代传统的有机基质，以达到抑制碎片、简化谱图等效果，实现了对小分子物质的检测。例如传统有机基质2，5二羟基苯甲酸（DHBA）在修饰的介孔硅材料辅助下，不但实现了基质碎片的充分抑制，而且能够有效提高待测氨基酸、代谢物等小分子化合物的MALDITOFMS质谱峰信号强度。 沸石是一种具有介孔结构的铝酸盐材料，作为催化剂和吸附剂广泛用于工业催化等领域[10]。在沸石的晶体结构中，由于Si4+被Al3+同晶置换，具有电负性的SiOAl桥键会被H+、NH+4、K+、Na+等离子平衡，如图1所示， 而且这些离子可以相互交换在沸石表面[11， 12]。沸石的种类非常多，结构也不同，常见的有Y型沸石、丝光沸石、Beta沸石、ZSM5沸石等。沸石结构中硅铝比（SiO2/Al2O3）的不同，其沸石的酸性、孔径大小、稳定性以及亲水性等都会随之变化，从而影响沸石催化活性等[13]。近年来，沸石材料在MALDI基质研究与应用方面，取得了一些新的进展。Komori等[14]将传统有机基质THAP嵌入质子化丝光沸石（HM20）介孔中，能够有效抑制THAP的质谱碎片，消除碱金属干扰的影响，提高目标分析物的信号强度。此外，银纳米颗粒负载介孔沸石作为无机MALDI基质，具有保护纳米颗粒在激光辐照下的完整性、消除纳米颗粒团聚效应、提高离子化效率、选择性离子化等优点[15]。 本研究重点考察介孔沸石材料负载传统基质CHCA用于MALDITOFMS分析小分子物质的效果。比较了不同硅铝比、不同介孔大小的沸石材料，分析与探讨沸石表面酸性大小及介孔结构对于检测的影响，并利用沸石修饰基质成功实现复杂基质中药物小分子的MALDITOFMS检测。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 Shimadzu Biotech Axima Performance MALDITOFMS质谱仪（日本岛津公司）， 配置N2激光源，激光波长337 nm，激光能量参数设定为30。 α氰基羟基肉桂酸（CHCA）、恩诺沙星D5同位素标记物、环丙沙星D8同位素标记物（美国Sigma公司）；恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星盐酸盐、培氟沙星、诺氟沙星等标准物质及鸡蛋样品，均来自农业部农产品质量标准研究中心；介孔沸石材料，包括Beta沸石及不同硅铝比（SiO2/Al2O3）的ZSM5沸石等， 购自先丰纳米材料科技有限公司（南京）；乙腈、甲醇等试剂均购于Merck公司。 2.2 实验方法 2.2.1 溶液配制 按照4∶2的质量比，分别称取传统基质CHCA和沸石（ZEO）颗粒，置于研钵中反复研磨混合15 min后，转移至样品瓶中，加乙腈水（1∶1，V/V）混合溶剂1 mL， 配制成浓度 4 mg/mL CHCA2 mg/mL ZEO的悬浊液。采用以上方法，分别配制CHCA与不同沸石材料的混合基质溶液：CHCA+Beta（40）、CHCA+ZSM5（38）、CHCA+ZSM5（170）、CHCA+ZSM5（500）（括号中的数字表示SiO2/Al2O3的比值）。采用相同的溶劑，配制4 mg/mL的CHCA基质溶液用于比较。 模型肽Substance P溶于乙腈水（1∶1，V/V），浓度为0.5 mg/mL；待测物恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星盐酸盐、培氟沙星、诺氟沙星等氟喹诺酮类药物小分子混合标准液用0.2%甲酸甲醇溶液配制，浓度分别为0.01 mg/mL。 2.2.2 样品前处理 在鸡蛋样品中加入适量恩诺沙星D5、环丙沙星D8同位素标记物，旋混、静置，待平衡后加入1%甲酸乙腈溶液（V/V）4 mL沉淀蛋白，涡旋2 min后，4℃下8000 r/min离心10 min，重复上述步骤，合并两次上清液。上清液中加入10 mL正己烷除脂，取下清液40℃氮吹干，复溶后过0.22 μm滤膜，待测。 2.2.3 质谱分析 分别取1.0 μL配制好的基质与待测样品于样品靶上混合，重复以上步骤后，待溶剂挥发完全，形成结晶后，利用MALDITOFMS仪器分析。待仪器状态稳定后， 连续采集100张质谱图的累加谱图作为最终结果，数据采用Igor Pro软件处理并分析。 3 结果与讨论 3.1 CHCA负载沸石用于MALDITOFMS分析的考察 选择模型肽Substance P（Sub P）为待测物，与传统有机基质CHCA直接混合于样品靶上，在正离子模式下进行MALDITOFMS分析，结果见图2A。可检测到待测物质谱峰[Sub P+H]+（m/z 1347）、[Sub P+Na]+（m/z 1369）， 同时也能明显观察到基质CHCA相关的质谱峰 [CHCA+H]+（m/z 190）、[CHCA+Na]+（m/z 212）和[2CHCA+H]+ （m/z 379），但是在200～400 Da质量范围内，有很多碎片离子。为抑制基质碎片，通过物理混合的方式，将CHCA负载于选择质子交换、SiO2/Al2O3比值为38的ZSM5沸石上。在相同的质谱条件下，利用此复合基质分析Sub P，如图2B所示。通過比较发现，采用ZSM5沸石复合基质，不但能有效抑制碱金属相关的质谱峰 [CHCA+Na]+、[SubP+Na]+以及离子碎片，简化谱图，而且可以极大提高Sub P的质子化峰[Sub P+H]+的强度。因此，ZSM5沸石的介孔结构对于CHCA的包裹作用，可有效保护CHCA分子的完整性，同时介孔结构的均匀分布又能够使CHCA很好地分散，提高MALDITOFMS测量的重复性。另一方面表明，沸石表面的质子发生了转移，并参与了Sub P离子化的过程，进而提高了其质子化峰强度。这与Yamamoto等揭示的沸石能够有效传递激光能量以及沸石表面质子有助于提高目标分析物质子化峰强度的作用机理一致[16]。 3.2 沸石表面酸性大小的影响 由于沸石表面酸性大小与其结构中SiO2/Al2O3比成反比，因此，为了进一步验证沸石表面质子对抑制碎片、提高样品离子化效率等的作用机理，选择相同结构类型、但硅铝比不同的ZSM5沸石进行比较。分别按照相同的比例与方法，将CHCA基质负载于SiO2/Al2O3比值分别为170和500的ZSM5（170）和ZSM5（500）沸石材料上，在相同的条件下对Sub P进行MALDITOFMS分析。从图3可见，与图2B比较，当表面质子减少后，基质与样品的碎片又明显增加，对碱金属相关碎片的抑制能力减弱，而且[SubP+H]+的峰强度也有降低。由此可见，沸石表面布朗氏酸位多少或酸性大小，对于抑制碎片、提高待测物峰强度有直接关系。在3种不同硅铝比的沸石中，ZSM5（38）沸石负载CHCA 的效果更好。 3.3 沸石结构的影响 沸石作为介孔材料，由于其基本单元不同，介孔的大小也不完全相同，因此，介孔对于CHCA分子的包裹能力也可能不同。为了考察介孔结构对于MALDITOFMS分析结果的影响，选择SiO2/Al2O3比值接近ZSM5（38）的Beta（40）沸石。结果如图4所示，采用Beta（40）沸石作为载体，对碎片的抑制作用更有效。通过与图2B比较发现，质谱峰[CHCA+H]+，[2CHCA+H]+明显降低，因此推测Beta（40）沸石介孔对CHCA的包裹能力更强。根据范德瓦尔斯分子体积公式[17]计算可知，CHCA分子的理论直径为0.68 nm，而所使用的的沸石材料ZSM5（38）与Beta（40）的表征结果显示，其介孔大小分别为0.53～0.55 nm和0.55～0.70 nm，结果与我们推测的一致。Beta（40）具有较大的介孔孔径，大于CHCA分子理论直径，对负载的CHCA包裹与保护能力更强，因此，对基质碎片的抑制作用也明显。 3.4 沸石基质用于药物小分子的MALDITOFMS分析 本研究选择了6种常见氟喹诺酮类药物小分子作为被分析物，包括恩诺沙星（ENR）、环丙沙星（CIP）、氧氟沙星（OFX）、洛美沙星（LOM）、培氟沙星（PEF）和诺氟沙星（NOR），考察了Beta（40）沸石负载的CHCA在药物小分子分析中的效果，同时与不负载的CHCA进行比较，如图5所示。图5A中， 6种氟喹诺酮类药物质谱峰分别为[ENR+H]+（m/z 360.67），[CIP+H]+（m/z 332.57），[OFX+H]+（m/z 362.66），[LOM+H]+（m/z 352.63），[NOR+H]+（m/z 320.54），[PEF+H]+（m/z 334.59），而且在质量数300～400 Da 范围内有大量的碎片。为了实现抑制干扰碎片的目的，实验选择了Beta（40）沸石负载的CHCA复合基质，在相同的实验条件下分析药物小分子，如图5B所示，6种氟喹诺酮类药物的质子峰明显，而且干扰的离子碎片被充分抑制，谱图简化。 为了考察沸石复合基质在实际复杂样品分析中应用的可行性，选择含有恩诺沙星和环丙沙星的阳性鸡蛋样品，在样品前处理前添加适量D8环丙沙星（D8CIP）和D5恩诺沙星（D5ENR）同位素标记物，待平衡后完成样品前处理后检测。如图6所示，恩诺沙星、环丙沙星及其同位素标记物的质谱峰[ENR+H]+（m/z 360.67）、[CIP+H]+（m/z 332.57）、[D5ENR+H]+（m/z 365.67）和[D8CIP+H]+（m/z 340.57）被成功检出，这为利用同位素内标实现MALDITOFMS定量分析提供了参考。 4 结 论 本研究结果表明，介孔沸石材料负载传统有机基质作为一种新型的复合MALDI基质，具有抑制干扰碎片、简化质谱图、提高质子化效率等优点，可应用于恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培氟沙星和诺氟沙星等氟喹诺酮类小分子以及复杂基质样品中此类小分子物质的MALDITOFMS分析。 |
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