| 标题 | 激酶检测方法的最新研究进展 |
| 范文 | 刘杨+邹笑然+李琛琛+张春阳 摘要激酶是生物体内一类重要的磷酸转移酶，能够催化磷酸基团由高能磷酸基团供体分子（如AP）向特定底物分子转移。激酶不但在新陈代谢、细胞信号传导、蛋白质调控、细胞传输等过程中起着关键作用，而且在临床诊断、药物研发及疾病靶向治疗等方面也发挥着重要作用。因此，发展灵敏度高、特异性好的激酶检测方法十分必要。本文以蛋白激酶A（Protein kinase A， PKA）、酪蛋白激酶（Casein kinase2， CKII）、多核苷酸激酶（ polynucleotide kinase， PNK）为例，对近年来发展的激酶检测方法进行了综述，着重介绍了荧光分析法、单分子检测、比色法、化学发光和生物发光分析法、电化学和光电化学分析法，并对激酶检测方法的发展方向进行了展望。 关键词激酶； 灵敏检测； 分析方法； 评述 1引 言 激酶（Kinase）是生物体内一类催化磷酸基团由高能磷酸基团供体分子（如AP）向特定底物分子转移的酶，其催化的磷酸基团转移过程亦称磷酸化。激酶的作用底物包括蛋白质、脂质、碳水化合物、核苷酸等。根据作用底物的不同，可分为蛋白激酶、脂质激酶、碳水化合物激酶等。激酶广泛参与新陈代谢、细胞信号传导、蛋白质调控、细胞传输等重要细胞过程，对维持生物体正常的生理功能十分重要。激酶的突变将导致激酶功能紊乱，激酶功能的失调与许多疾病的发生发展密切相关[1，2]。由于激酶在细胞中起着信号调节作用，激酶亦是重要的药物靶标[3]。 在种类众多的激酶中，蛋白激酶（Protein kinase）是最大的一类激酶族群。人类基因组中存在518种蛋白激酶基因， 约占其总量的2%[，5]。蛋白激酶能够将磷酸基团从核苷三磷酸（通常是腺苷5'三磷酸，AP）转移到底物蛋白特定的氨基酸残基上，催化蛋白质的磷酸化反应。根据其底物蛋白被磷酸化的氨基酸残基种类不同，蛋白激酶可分为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶、组氨酸蛋白激酶、色氨酸蛋白激酶、天冬氨酰基/谷氨酰基蛋白激酶五类。蛋白激酶通过调节底物蛋白的活性、相互作用[6，7]及稳定构象，间接调节细胞功能（如细胞循环、细胞凋亡、代谢和蛋白合成）[8]，并在细胞信号转导通路[9]、免疫应答[10]、细胞周期调节[11]和能量平衡[12]等过程中起关键作用。蛋白激酶的突变和活性的失调可导致一系列疾病的发生，如癌症[11]、糖尿病并发症[13]、神经病症和神经变性疾病[1]以及心脏功能障碍[15]等。蛋白激酶已成为疾病的药物治疗靶标[16，17]，美国食品药品监督局（DA）已批准多种蛋白激酶抑制剂用于癌症治疗[18]。 多核苷酸激酶（Polynucleotide kinase，PNK）也是一种具有重要生理功能的激酶，广泛存在于真核细胞和原核细胞中。PNK同时具有5'激酶和3'磷酸酶活性，可以催化DNA或RNA分子末端，将5'O/3'PO转化成5'PO/3'O[19]。通过催化5'羟基末端的磷酸化，PNK在许多细胞活动（如DNA重组[20]和DNA/RNA修复[21]）中起着至关重要的作用。研究表明，PNK的突变能导致多种疾病的發生，如小头症和癫痫[22]、Werner综合征、Bloom综合征和Rothmundhomson综合征等[23]。 激酶广泛参与生物体内多种细胞过程，在复杂的生命活动中起着至关重要的作用。因而发展灵敏度高、特异性好、操作简单、成本低的激酶活性检测方法，在激酶功能研究、临床诊断、药物筛选以及疾病靶向治疗等方面都具有重要意义。激酶活性检测的常规方法包括放射性同位素标记法、放射自显影像法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法[19，2～26]。但是这些方法存在放射性污染、检测耗时、操作繁琐、不适用于大规模筛选等缺点。因此，迫切需要发展简单、快速、超灵敏且环境友好的激酶检测方法。近年来，非放射性检测方法如荧光分析法、比色法、电化学分析法、化学发光和生物发光分析法等蓬勃发展，在激酶检测研究中显示出独特的优势[27]。本文主要以蛋白激酶A（Protein kinase A， PKA）、酪蛋白激酶（Casein kinase2，CKII）、多核苷酸激酶（ polynucleotide kinase， PNK）为例，结合本课题组的工作，综述近年激酶活性检测方法的研究进展。PKA又称为依赖于cAMP的蛋白激酶A （CyclicAMP dependent protein kinase A），是目前研究最广泛的蛋白激酶，常作为激酶活性检测的模型[28，29]； CKII是一种普遍参与细胞生长、增殖、凋亡等重要生理过程[30]的蛋白激酶，其异常表达与多种疾病密切相关； PNK是一种由噬菌体的pse基因编码的激酶，常作为多聚核苷酸激酶的模型被广泛研究，同时也是核酸探针标记和基因工程中重要的工具酶[31，32]。 2激酶的检测方法 21荧光分析法 与传统的分析方法相比，荧光分析法具有灵敏度高、特异性好、操作简单、适用于高通量分析等优点。近年来，荧光分析法与新型纳米材料、等温扩增技术相结合，广泛应用于激酶检测的研究。石墨烯氧化物（GO）是一种单分子层厚度的二维（2D）碳纳米材料，能有效猝灭荧光基团的发光。GO具有可控的表面吸附性质，是构造生物传感器的最佳选择[33]。Lin等[3]将GO和λ核酸外切酶相结合，对多核苷酸激酶（ PNK）的活性和抑制作用进行分析，检出限为005 U/mL。该方法无需复杂的探针设计，具有操作简单的优点。Sun等[35]将GO与核酸外切酶III（Exo III）和连接酶介导的循环反应相结合，实现了荧光信号的猝灭和放大，将 PNK的检出限降低至0003 U/mL。该方法无需设计特定的酶识别序列，灵敏度高。hou等[36]构造了一种新型GO肽纳米传感器，可定量检测蛋白激酶。发生磷酸化的肽链会抑制羧肽酶Y（CPY）的降解，导致染料标记的肽链吸附到GO表面，荧光信号被猝灭； 而未发生磷酸化的肽链被CPY降解，荧光信号不受GO影响。该方法已成功应用于检测CKII和PKA，检出限分别为00833和0130 mU/μL。该方法具有操作简单、稳定、灵敏度高等优点，可同时进行荧光各向异性分析。 除石墨烯氧化物外，一系列新型纳米材料也广泛应用于构建激酶的荧光分析体系。Li等[37]设计了一种发夹结构探针修饰的多功能磁性纳米微球，结合聚合切口反应介导的超支化滚环扩增（RCA），对 PNK活性进行灵敏检测，检出限可达0036 mU/mL。 该方法可用于定量分析细胞提取物中 PNK活性。Qing等[38]利用哑铃状DNA模板合成铜纳米粒子，应用于 PNK和连接酶活性的检测。该方法无需荧光标记，对 PNK检出限为005 U/mL。 Cen等[39]利用羟基氧化物CoOO纳米片作为探针，结合λ核酸外切酶裂解反应检测 PNK活性，检出限可达001 U/mL。Liu等[0]利用稀土掺杂的上转换荧光纳米粉（UCNPs）构建了发光能量共振转移（LRE）体系，用于蛋白激酶PKA分析（图1）。在该体系中，稀土掺杂的上转换荧光纳米粉NaY：Yb，Er作为LRE供体以及磷酸化肽链的识别基质，四甲基罗丹明（AMRA）标记的底物肽链作为LRE受体。染料标记的底物肽链被PKA磷酸化后，能被UCNPs中的稀土离子特异性捕获，实现AMRA与UCNPs之间的LRE过程，产生荧光信号。该方法无需添加额外的识别分子，操作步骤简单。由于UCNPs允许多个低频光子的激发，因而能够避免自发荧光和光散射等背景干扰，信噪比好，灵敏度高，检出限可达5×10Symbolm@@ 5 U/μL。 基于主客體相互作用对荧光染料分子的保护，环糊精及其聚合物能显著增强荧光分子的发光效应[1]，可用于构建激酶的荧光检测系统。Song等[2]发展了基于β环糊精聚合物（polyβCD）和λ核酸外切酶反应的 PNK活性分析方法。polyβCD能使染料分子的荧光信号增强10倍以上，显著提高激酶检测的灵敏度，检出限可达002 U/mL。该方法避免了DNA探针的双标记和复杂设计，可用于复杂样品分析。Xu等[3]利用芘作为荧光探针，利用γ环糊精结合DNA托链位移反应（SDR）实现两次荧光信号放大，显著提高 PNK检测的灵敏度，检出限达93×10Symbolm@@ 5 U/mL。 最近，hang等[]开发了一种λ核酸外切酶辅助的纸基荧光分析法，可用于PNK活性的检测。该方法通过分析醛基改性纸张表面Cy5荧光强度的变化检测PNK活性，检出限为00001 U/mL。Cheng 等[5]将DNA链置换反应与酶辅助扩增相结合，用于检测 PNK活性。该方法无需进行荧光标记，灵敏度高，检出限可达66×10Symbolm@@ U/mL。hang等[6]发展了一种流式细胞术磁珠测定法（CBA），用于超灵敏检测 PNK活性。该方法利用杂交链反应（CR）扩增技术对磁珠表面的荧光信号进行放大，同时利用流式细胞术读取磁珠表面的荧光信号，检出限可达×10Symbolm@@ 6 U/mL。该方法灵敏度高，特异性好，适用于复杂生物基质的检测。 22单分子检测 单分子检测技术能够在单分子水平上对目标分子进行超灵敏检测，具有灵敏度高、信噪比好、检测样本需求量少等优点，在生化分析领域得到广泛应用。Wang等[7]构建了基于单个量子点（QD）的纳米传感器，可对蛋白激酶PKA进行超灵敏检测（图2）。当PKA和磷酰基供体γ生物素AP存在时，Cy5标记的底物肽链可同时实现磷酸化和生物素化，并自组装到修饰有链霉亲和素的QD表面，形成Cy5肽QD夹心纳米结构，实现QD和Cy5之间的RE。通过全内反射荧光（IR）显微镜可对RE信号进行准确测量，用于PKA定量分析。该方法操作简便，无需洗涤和分离步骤，灵敏度高，检出限为93×10Symbolm@@ 6 U/μL。该方法还可用于筛选PKA抑制剂和激活剂。 本课题组[8]利用金纳米粒子（AuNP）对荧光信号的猝灭及磷酸化诱导的荧光信号恢复，结合λ核酸外切酶介导的裂解反应，在单分子水平上对PNK进行检测（图3）。当 PNK存在时，发夹探5'羟基末端磷酸化，随后在λ核酸外切酶作用下，发夹探针展开并暴露结合探针序列。结合探针与Cy5捕获探针AuNP纳米复合体中的捕获探针杂交，形成双链DNA（dsDNA）。该dsDNA能被λ核酸外切酶裂解，释放出Cy5分子和结合探针。释放的结合探针能与新的Cy5捕获探针AuNP纳米复合体中的捕获探针杂交，引发新一轮的杂交裂解释放，最终释放出大量Cy5分子。基于IR的单分子荧光检测方法能对Cy5分子进行荧光成像，用于 PNK定量分析，检出限为977×10Symbolm@@ 8 U/μL。该方法可以定量检测癌细胞提取物中的 PNK，并可用于筛选 PNK抑制剂。 该方法灵敏度高、通用性强，通过设计合适的DNA底物和选择合适的荧光基团，可实现多种核苷酸激酶的同时检测。 23比色法 比色法是通过比较或测量有色溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。该方法具有操作简单、成本低、直观可见等优点[9]。将纳米材料和生物酶催化反应引入比色分析，极大的拓展了比色法的应用范围，为激酶的检测开辟了新途径。欧丽娟等[50]建立了一种基于纳米金凝聚变色效应的比色方法，用于检测 PNK活性。无 PNK时，由于静电效应和空间位阻效应，发卡探针修饰的金纳米颗粒能够稳定存在溶液中，溶液颜色为纳米金单分散状态时的红色。当 PNK存在时，发卡探针发生5'羟基磷酸化，随后λ核酸外切酶将发卡探针从金纳米颗粒切除，导致纳米金颗粒因无DNA链保护而发生聚集，溶液变为蓝紫色。该方法简单直观，仪器依赖程度低，检出限为02 U/mL。Liu等[51]发展了一种基于G四链体/氯高铁血红素DNA酶的免标记比色法，用于检测 PNK活性。他们设计了3'端G碱基富集的发夹探针以及和发夹探针部分互补的3'磷酸引物DNA。 PNK能将3'磷酸引物DNA催化为3'羟基引物DNA，并引发引物DNA的延长反应，导致发夹探针展开和G四链体形成。G四链体可以和溶液中的氯高铁血红素结合形成G四链体/氯高铁血红素DNA酶，催化2O2氧化2，2'联氮双（3乙基苯并噻唑啉）6磺酸（ABS2 Symbolm@@ ）反应，导致溶液颜色变化。该方法无需复杂标记，灵敏度高，检测极限为001U/mL。该方法还可用于 PNK抑制剂的筛选。 2化学发光分析法 化学发光分析法通过测量化学发光反应中发光物质由激发态跃迁回基态时发出的光信号，实现对目标分子的检测[52]。化学发光分析法無需额外光源，具有灵敏度高、信号收集迅速以及易于实现自动化等优点[53]。化学发光分析与其它技术联用极大拓展了其应用范围。将扩增技术引入化学发光分析，能够显著提高激酶检测的灵敏度和特异性。ang等[5] 发展了一种基于滚环扩增（RCA）诱导的化学发光分析法，用于超灵敏检测PNK活性（图）。 PNK催化单链DNA底物发生磷酸化反应，随后与挂锁探针杂交，在DNA连接酶作用下形成一个封闭的环状DNA。环状DNA和挂锁DNA可分别作为RCA反应的模板和引物，生成具有DNA酶功能的单链DNA，并在氯高铁血红素分子协助下折叠成G四链体结构，催化鲁米诺2O2反应，产生化学发光信号。该方法利用RCA的高效扩增和DNA酶诱导的化学发光信号增强，可超灵敏检测 PNK活性，检出限达220×10Symbolm@@ U/mL。该方法可用于筛选 PNK抑制剂和激活剂，并可应用于实际样品分析。 Li等[55]将功能化磁性微粒（MMPS）和催化发夹组装（CA）反应相结合，构建了一种灵敏的DNA walker生物传感器，可用于 PNK活性检测。他们通过CA反应将生物素标记的发夹DNA组装到MMPS表面，随后利用链霉亲和素生物素相互作用将辣根过氧化物酶组装到DNA walker传感器，催化化学发光体系产生信号。该方法灵敏度较高，特异性好，检出限为0003 U/mL。 除了化学发光分析法，电致化学发光（ECL）也广泛应用于激酶的超灵敏检测。ECL分析法通过检测电化学反应产生的化学发光信号对目标分子进行分析。ECL方法具有高灵敏度、低背景、检测装置简单、反应时间和空间可控等优点[56～60]。联吡啶钌络合物及其衍生物是最常用的电致化学发光剂。Dong等 [61]发展了基于联吡啶钌络合物[Ru（bpy）3]2+功能化金纳米粒子 （[Ru（bpy）3]2+AuNPs）的电致化学发光生物传感器，用于检测蛋白质激酶CKII和PKA活性。在蛋白激酶和5'硫代三磷酸腺苷（APs）存在时，自组装到金电极上的底物肽能够特异性地发生硫代磷酸化反应。通过静电作用结合的[Ru（bpy）3]2+AuNPs复合体可与肽链中的硫代磷酸基团通过AuS键连接，自组装到金电极的表面，并在共反应物三丙胺的作用下产生ECL信号。该方法灵敏度高，特异性好，对CKII和PKA的检出限分别为0008和0005 U/mL。该方法可应用于检测血清样本中CKII活性，也可用于CKII和PKA抑制剂的筛选。Liu等[62]利用钌衍生物标记的蛋白作为ECL探针，用于检测蛋白激酶PKA和CKII活性。蛋白激酶可将组装到金电极表面的底物肽链中的丝氨酸磷酸化，单克隆磷酸化丝氨酸抗体能够识别并结合肽链中磷酸化的丝氨酸，同时钌衍生物标记的蛋白A（ECL探针）可特异性与磷酸化丝氨酸抗体结合，因而ECL探针可组装到金电极表面实现ECL。该方法非常灵敏，对PKA和CKII的检出限分别为0005和000 U/mL。 他们进一步发展了ECL成像，实现了001～00 U/mL范围内PKA和CKII的同时检测。该方法还可以用于激酶抑制剂的筛选和细胞中蛋白激酶活性的检测。 25生物发光分析法 本课题组[63]发展了一种通过实时检测磷酸化依赖的DNA连接反应实现 PNK活性检测的生物发光分析法（图5）。在该方法中，两个具有5'突出末端的发夹DNA探针作为磷酸基团受体，dCP作为磷酸基团供体。在无 PNK存在时，发夹DNA探针中缺少5'磷酰基，不能触发DNA连接反应，无生物发光信号产生。当 PNK存在时，两个发夹DNA探针发生5'端磷酸化，在DNA连接酶作用下发生DNA连接反应，释放出AMP，其向AP转化过程中产生生物发光信号。通过监测生物发光信号，可实现 PNK活性的实时分析，检出限为000 U/mL。该方法无需标记，无需外部光激发，无自发荧光干扰，操作简单，可应用于PNK的定量分析、动力学分析以及抑制剂的筛选。 26电化学分析法 电化学分析法具有灵敏度高、选择性好、操作简单和成本低等优点[6]，在激酶检测中具有广泛应用。Yin等[65]利用肽链磷酸化对羧肽酶Y（CPY）活性具有抑制作用的原理，发展了可对蛋白激酶CKII活性进行灵敏检测的电化学分析法。在CKII存在时，自组装在金电极表面的CKII底物肽链发生丝氨酸位点磷酸化，该位点的磷酸化可抑制CPY对底物肽链的消化，保持肽链和氧化还原探针e（CN）3 Symbolm@@ 6之间的排斥力，产生微弱的电化学信号。当无CKII存在时，CPY将底物肽链完全水解为氨基酸，导致排斥力消失，产生强电化学信号。通过监测电化学信号可实现蛋白激酶的活性分析。该方法灵敏度高，检出限为007 U/mL，能在复杂体系中对CKII进行活性分析。 最近，微芯片和新型纳米复合材料的引入极大丰富了激酶的电化学分析方法。Chand等[66]构造了一种EIS传感微芯片，通过检测PKA特异性适配体修饰的EIS传感器表面电荷的变化，实现对PKA的特异性分析，检出限为2 U/mL。该传感器还可与其它生物传感器集成，用于多重分析。Liu等[67]利用纳米金颗粒多壁碳纳米管复合物（AuNPs/MWNs）的催化作用，发展了对蛋白激酶PKA进行超灵敏检测的电化学分析法，检出限为009 U/mL。hou等[68]将Au@C纳米复合材料、链霉亲和素SiO2复合物及AuNPs生物素化β半乳糖苷酶相结合，构建了可分析PKA活性的电化学生物传感器，检出限为001 U/mL。 27光电化学分析法 光电化学（PEC）分析法是基于光活性物质的光电转换性质检测待测物的一种方法，通过检测光活性物质被激发后产生的光电流，可实现对目标物质的灵敏分析。光电化学分析法具有灵敏度高、操作简单、检测装置成本低等优点，在生化分析领域具有广阔应用前景[69～75]。光电化学分析法中常用的光活性物质包括无机半导体材料（如CdS量子点和iO2纳米粒子等）、有机半导体材料（联吡啶钌衍生物和卟啉及其衍生物等）和复合半导体材料[7]。hou等[76]利用Bi2S3纳米棒和AuNPs修饰的IO电极，结合生物素标记的phostag构建可灵敏检测蛋白激酶PKA的PEC生物传感器，检出限达0017 U/mL。Yin等[77]利用gC3NAuNPs复合纳米材料及生物素标记的phostag和碱性磷酸酶（ALP）催化的信号放大原理，构建了可对PKA灵敏检测的信号增强型PEC生物传感器，检出限为0015 U/mL。最近，Li等[78]利用gC3NiO2复合纳米材料、PAMAM树状大分子和碱性磷酸酶（ALP）引发的信号放大，构建了可进行PKA活性分析的新型PEC生物传感器。该方法在溶液中进行磷酸化反应，有利于反应充分进行，操作步骤简单，灵敏度高，检出限为008 U/mL。huang等[79]利用AuNPs和gC3N纳米片复合材料对电极进行修饰，结合等温扩增技术和氯高铁血红素/G四链体DNA酶辅助的生物催化沉淀，实现了 PNK的灵敏分析。该方法中，AuNPs表面的等离子共振增强效应使PEC体系的光电流信号增大100%，等温扩增技术和DNA酶辅助的生物催化沉淀等多种信号放大技术的联用显著提高了检测灵敏度，检出限达10 mU/mL。 最近，Wang等[80]利用金属有机骨架化合物（MOs）构建了可超灵敏检测蛋白激酶的PEC生物传感器。在蛋白激酶PKA存在下，修饰于iO2/IO电极上的底物肽发生磷酸化反应。由于具有r+表面缺陷，载有PEC光活性物质[Ru（bpy）3]2+的锆团簇金属有机骨架材料（[Ru（bpy）3]2+@UiO66）可通过螯合作用与磷酸化的底物肽结合，使[Ru（bpy）3]2+@UiO66与iO2/IO电极相连。[Ru（bpy）3]2+在可见光照射下产生受激电子，该电子注入到iO2导带中产生光电流信号。锆团簇金属有机骨架材料具有表面积大和孔隙率高的特点，能吸附大量[Ru（bpy）3]2+，显著增强PEC体系的光电流信号，检出限可达0009 U/mL。 3总结与展望 激酶是生物體内重要的磷酸转移酶，通过催化底物分子的磷酸化过程广泛参与细胞信号传导、细胞复杂过程的调控，是重要的药物标靶。激酶活性的灵敏检测在疾病诊断、药物研发和靶向治疗等领域具有重要意义。由于易产生放射性废物、操作繁琐等问题，传统的放射性同位素标记法、放射自显影像法等已逐渐被非放射性分析方法所取代。在新发展的激酶分析方法中，荧光分析法应用最为广泛，具有如下优点：（1）灵敏度高，应用范围广； （2）荧光团无需特殊处理，环境友好； （3）基于荧光的分析技术（例如RE和LIM）有望实现活体检测和成像。另外，其它新发展的方法也各具特点：比色法操作简单且成本低[81]； 化学发光分析法无需外光源，操作方便，分析快速，易实现自动化； 电化学分析法简单快速，成本较低[82]。目前，发展简单、快速、成本低廉、灵敏度高的激酶活性分析方法仍然是一个挑战。值得注意的是，近几年涌现的新技术单分子检测法具有灵敏度高和样品消耗量低等优点，在激酶活性分析领域具有广阔应用前景。纳米材料具有良好的光学性能和可控的表面吸附性能，为构建新型激酶生物传感器提供了新材料。一些高效扩增技术如滚环扩增（RCA）和杂交链反应（CR）的引入，为发展高灵敏的激酶分析方法指引了新方向。我们坚信随着激酶分析方法的不断发展，激酶在药物开发、临床诊断以及生化分析等领域中的应用前景也将越来越广阔。 References 1Lahiry P， orkamani A， Schork N ， egele R A Nat Rev Genet， 2010， 11（1）： 60-7 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