| 标题 | 牛磺酸对心肌成纤维细胞作用解析 |
| 范文 | 王立英 卞良奇 苏小伟 苏海燕 刘絮 刘楠楠 摘?要?研究了牛磺酸（Taurine， Tau）对新生大乳鼠心肌成纤维细胞（Myofibroblasts， myoFbs）增殖的抑制作用，并探讨其作用機制。应用血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ， AngⅡ）诱导体外培养新生大乳鼠的myoFbs增殖，建立了心肌纤维化（Myofibrosis， MF）模型，基于甲基偶氮唑盐法检测myoFbs增殖。结果表明，不同浓度（0.03、0.06和0.12 mol/L）Tau均可显著抑制myoFbs增殖，且呈现出剂量依赖性。进一步应用免疫细胞化学、激光共聚焦显微镜及 ELISA方法检测了活性氧（Reactive oxygen species， ROS）、细胞周期蛋白E（Cell cycle protein E， CyclinE）、核转录因子κBp65（Nuclear factor-kappa Bp65， NF-κBp65）及转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1， TGF-β1）在myoFbs中的的表达及含量。研究结果表明，Tau是通过减少ROS的产生及TGF-β1的表达、抑制NF-κBp65的核转位及CyclinE的表达，抑制myoFbs增殖，起到抗MF的作用。 关键词?牛磺酸; 心肌成纤维细胞; 甲基偶氮唑盐法; 活性氧; 细胞周期蛋白E 1?引 言 牛磺酸（Taurine， Tau）又称β-氨基乙磺酸，是人体内含量极其丰富的自由氨基酸，在心肌组织中占总游离氨基酸含量的60% 以上。研究表明，Tau可通过调节细胞内外的渗透压、调节Ca2+浓度的稳定及抗氧化等对心肌细胞起到保护性作用[1～3]。近年的研究还发现，Tau在体内及体外大鼠心肌纤维化（Myofibrosis， MF）模型中显示出抗MF的作用[4～6]，但此作用与胞内何种信号分子有关及其作用机制目前尚不明确。本研究用AngⅡ诱导新生大乳鼠心肌成纤维细胞（Myofibroblasts， myoFbs）的增殖[1～3]，基于四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（Methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）、激光共聚焦、ELISA及荧光探针2，7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate（DCFH-DA）等定性和定量方法，获得不同处理因素对对照组（Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM培养液）、模型组、Tau各剂量组对myoFbs增殖的影响，并进一步对检测结果进行系统性对照和统计学分析，考察Tau抑制myoFbs的增殖是否与活性氧（Reactive oxygen species， ROS）、细胞周期蛋白E（CyclinE）、核转录因子κBp65（Nuclear factor-kappa Bp65， NF-κBp65）及转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1， TGF-β1） 等相关，探讨Tau抑制myoFbs增殖的胞内信号转导作用机制。 2?实验部分 2.1?仪器与试剂 Olympus CK40倒置显微镜（日本Olympus公司）; HYBRID激光共聚焦显微镜（日本Lasertec公司）; Sunrise酶标仪（美国美谷分子仪器有限公司）; Sorvall低温离心机（美国Thermo公司）。 牛磺酸（纯度99%，国药集团上海化学试剂公司）; 血管紧张素Ⅱ、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT， 美国Sigma公司）; Iscove's Modified Dulbecco's Medium （IMDM）、胰蛋白酶（美国Bco公司）; 胎牛血清（杭州四季青生物公司）; 活性氧试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所）; TGF-β1检测试剂盒（上海通蔚实业有限公司）; 羊抗大鼠CyclinE和NF-κBp65一抗（美国Santa Cruz公司）; S-P试剂盒（福州迈新生物技术开发公司）; 碘化丙啶（美国Biotium公司）; 二甲基亚砜（DMSO，苏州联雄精细化工科技有限公司）; DAB显色液（北京博奥森生物技术有限公司）; FITC兔抗山羊二抗 （北京中杉金桥生物技术有限公司）。Wistar 大鼠的仔鼠（1～3日龄，雌雄兼用，清洁级），由吉林大学实验动物中心提供。 2.2?MyoFbs分离及培养 取1～3日龄Wistar大鼠乳鼠，无菌开胸取其心脏，用预冷的D-Hank's冲洗心脏两次后，将其剪成1 mm3的碎片，用胰蛋白酶（0.125%，w/V）多次消化（37℃， 5 min/次），收集上清液，1200 r/min离心10 min，弃去上清液，用含胎牛血清的IMDM培养基重悬沉淀细胞，将其接种于100 mL培养瓶中，于37℃、5% CO2培养箱内培养。实验采用第2～3代细胞。 2.3?实验分组及给药 MyoFbs分为正常对照组、模型组、Tau各剂量组。各组细胞无血清培育12 h后，给予1%血清的IMDM培养基，除对照组外，均给予终浓度为1×107 mol/L的AngⅡ，Tau各剂量组的终浓度分别为0.03、0.06和0.12 mol/L。 2.4?细胞增殖检测 将处于对数生长期的myoFbs制成细胞悬液，以1×105 cell/mL浓度接种于96孔板，每孔200 μL。分别给予不同的处理因素作用48 h。每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，37℃ 继续培养4 h，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min后，于酶标仪上490 nm波长测吸光度（A）值，细胞增殖率（Cell proliferation rate， CPR）按下式计算： 式中， A1和A0分别为药组和对照组的吸光度。 2.5?TGF-β1含量测定 取第3代myoFbs制成细胞悬液，以2.5×105 cell/mL浓度接种于24孔板，每孔1 mL。按2.3节的方法给予不同因素的处理，分别在培养48 h后吸取细胞上清液，用TGF-β1 ELISA试剂盒检测TGF-β1的含量。 2.6?CyclinE和NF-κBp65蛋白表达的检测 取第3代myoFbs放入预先放置了10 mm×10 mm盖玻片的24孔板内，在37℃、5% CO2培养箱内培养48 h，再经无血清培育12 h，在不同条件下处理24 h后，将生长有myoFbs盖玻片取出，用预热PBS洗涤3次， 多聚甲醛（4%，w/V）固定30 min，晾干后用SP法进行细胞化学染色。阳性反应胞核呈棕黄色细密颗粒，阴性对照是用PBS代替一抗染色。应用Image-Pro Plus 5.0V （MediaCybernetics公司）图像分析软件分析各组CyclinE和NF-κBp65在myoFbs中表达的平均光密度值。 2.7?活性氧表达的检测 24孔培养板培养myoFbs 48 h，无血清再培育12 h后，各处理因素再作用24 h后，用预热的PBS洗涤3次，去除细胞培养液; 加入终浓度为10 mmol/L的DCFH-DA，于37℃、5% CO2培养箱内孵育20 min， 再用无血清培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，应用激光共聚焦显微镜观察myoFbs内的ROS的水平。 2.8?统计学分析 用SPSS软件进行实验数据分析，通过方差分析及q检验进行组间比较，以p<0.05为有显著差异且有意义; 实验数据以±s表示。 3?结果与讨论 3.1?Tau对myoFbs增殖的影响 体外实验中，myoFbs的增殖程度用细胞增殖率表示，即各实验组与对照组吸光度（A490为100%）的比值。模型组细胞增殖率值明显高于对照组（p<0.01），Tau（0.03～0.12 mol/L）作用myoFbs 48 h后，与模型组相比，均可不同程度降低细胞增殖率值（p<0.01或p<0.05），且呈现量效关系。研究表明，肾素-血管紧张素-醛固酮系统（Renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的激活是诱发及引起 MF 的主要机制，AngⅡ不仅是常见的刺激信号，也是致器官纤维化的重要因子，尤其可引起MF [5～8]。AngⅡ与 AT1受体结合后激活蛋白激酶C，随即启动胞内信号途径，促进 myoFbs增殖[6]。从实验结果可知，Tau可抑制AngⅡ诱导的myoFbs增殖，具有抗MF及心肌保护性作用[12～14]。 3.2?Tau对TGF-β1含量的影响 AngⅡ作用于myoFbs 48 h后，细胞培养液中TGF-β1含量明显升高，与对照组相比，差异显著（p<0.01）; 经不同浓度Tau作用后，各组myoFbs细胞培养液中TGF-β1的蛋白含量均不同程度减少（p<0.05 或 p<0.01），结果见表1。在MF过程中，TGF-β1是一种促器官纤维化的因子。体内外实验结果表明，MF与TGF-β1的异常表达密切[6，7]。TGF-β1不但能促进基质蛋白的合成，而且与AngⅡ密切相关。在MF过程中，TGF-β1与其受体结合，一方面AngⅡ能提高TGF-β1基因表达; 另一方面TGF-β1能促进myoFbs中I、III型胶原mRNA基因及细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）蛋白表达。TGF-β1对myoFbs的分化、增殖和胞外基质的沉积都具有极其重要的作用。离体实验表明，AngⅡ可促进myoFbs分泌TGF-β1，而高表达的TGF-β1使胞外基质合成增加[8，9]。本研究结果表明，Tau可降低AngⅡ诱导myoFbs中的TGF-β1表达，抑制MF的发生。 3.3?Tau对CyclinE表达的影响 机体内的细胞周期蛋白包括Cyclin A、CyclinB、CyclinD、CyclinE、CyclinG及CyclinH，每种周期蛋白都与之关键的蛋白激酶相结合，并调节相应激酶活性，从而引起细胞周期的改变。Cyclin E是调节细胞周期的正向因子，可使细胞快速通过G0/S期。研究表明，过量表达的Cyclin E会使细胞G1期明显缩短，提前进入S 期，干扰核酸的分裂和复制，干扰染色体的形成，促进中心体大量增殖以及干扰有丝分裂，促进细胞增殖，导致MF的发生。活化后的Cyclin E在胞核中表达为棕黄色或棕褐色颗粒，以胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。但对Cyclin E在细胞增殖中的作用，目前研究得较少[7～11]。本研究采用不同浓度Tau处理myoFbs 48 h后，从Cyclin E免疫细胞化学染色结果可见，对照组myoFbs核中Cyclin E的核表达量较少，AngⅡ组胞中Cyclin E的核表达较多，明显高于对照组（p<0.01），不同剂量组的Tau均可抑制Cyclin E的核表达（p<0.01或p<0.05）。 3.4?Tau对myoFbs的NF-κBp65表达的影响 在正常情况下，P50/P65/IKB三聚体构成NF-κB，是重要的胞核转录因子，在胞浆中以無活性的形式存在。在氧自由基、细胞因子等外来刺激作用下，IkB迅速降解，随即NF-κB被激活。活化后的NF-κB转移至核中，与相应的基因调节区域相结合，启动基因转录。研究表明，NF-κBp65与细胞的增殖关系密切，通过增加NF-κBp65的核表达，可促进细胞的增殖。本研究应用免疫细胞化学染色技术观察Tau对于NF-κBp65核表达的影响，不同浓度Tau与myoFbs孵育 48 h后，AngⅡ模型组细胞核黄褐色颗粒较多且核深染，与对照组相比，差异显著（p<0.01）。不同浓度Tau可不同程度地减少myoFbs胞核黄褐色颗粒数量，即NF-κBp65的核表达减少（p<0.05）。上述结果说明，Tau可通过抑制NF-κBp65的核转位，进而抑制myoFbs的增殖，达到抗MF的作用[7～11]。 3.5?Tau对ROS表达的影响 细胞在有氧代谢过程中产生的ROS，其主要功能是使细胞变性及坏死。此外，ROS可作为重要信号分子，参与到细胞信号转导过程中，激活转录因子，影响基因的表达，从而促进细胞的增殖、分化。本研究利用活性氧检测试剂盒测定ROS，探索ROS与myoFbs增殖之间的关系。活性氧检测试剂盒是利用荧光探针（DCFH-DA）进行 ROS检测，DCFH-DA 本身无荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内，被胞内的酯酶水解，生成DCFH。而 DCFH 不能通透细胞膜，使探针很容易地被装载到细胞内。细胞内的 ROS 可氧化无荧光的 DCFH，生成有荧光的DCF。检测 DCF 的荧光即可知细胞内 ROS 的水平[6，8，11]。本研究中采用激光共聚焦显微镜观察 myoFbs 胞浆内 ROS含量的变化，在 myoFbs 胞浆中可见绿色荧光颗粒，证明有ROS 产生，颗粒荧光越强，表明 ROS 量越高。实验结果表明，过量的 AngⅡ可使 NADPH 氧化酶被大量激活，产生过量的ROS，参与了MF及心肌重塑的发生发展过程[6，8]。与对照组比较，AngⅡ模型组ROS产生量最多（p<0.01）; ?与模型组相比，Tau各组ROS产生量减少（p<0.01或p<0.05）。应用 Image-Pro Plus5.0V图像分析软件分析。 4?结 论 采用不同检测技术，考察了Tau对新生大乳鼠心肌成纤维细胞增殖过程不同产物的影响，并进行系统性的数据解析，结果表明，Tau通过减少ROS和TGF-β1的生成、抑制CyclinE和NF-κBp65表达，抑制myoFbs增殖。本研究為临床上抑制MF及心肌重塑提供了新思路，为相关生物学研究提供了有价值的基础性参考数据。 References 1?LUO Can， GUO Lian-Jun. 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