| 标题 | 基于DNA模板点击化学和催化发夹型DNA自组装反应的新型均相电化学生物传感器检测miRNA-21 |
| 范文 | 汤玉娇 戴诗岩 周羽婷 程圭芳 何品刚 方禹之 摘?要?构建了一种利用DNA模板点击化学和催化发夹型DNA自组装反应（Catalyzed hairpin assembly，CHA）指示并放大信号，检测miRNA-21的新型均相电化学生物传感器。根据目标物miRNA-2的序列设计了两种发夹结构的探针，分别修饰5-氨基-2，3-二氰基-1，4-萘醌（ADNQ）和3（2-呋喃）丙酸（FPA），利用目标物miRNA-2引发的两种探针间的催化发夹组装使ADNQ和FPA的分子间距缩小，发生Diels-Alder反应，在实现目标物循环信号放大的同时，破坏ADNQ的化学结构，导致电化学响应信号降低，据此检测miRNA-21的浓度。采用循环伏安法（CV）、差分脉冲伏安法（DPV）和凝胶电泳等考察了此传感器的分析性能。结果表明，在0.1～1.0×104 pmol/L浓度范围内，此传感器响应电流变化值与miRNA-21浓度的对数呈线性关系，检出限为0.037 pmol/L（S/N=3）。将此传感器用于小鼠血清和全血裂解液样品的检测，结果表明， 本传感器适用于miRNA-21的检测。 关键词?DNA模板点击化学; Diels-Alder反应; 催化发夹组装; 电化学生物传感器 1?引 言 miRNAs是一类长度为19～25个核苷酸的非编码RNA，在多种肿瘤中表达水平高于正常水平，可作为代表性的肿瘤生物标记物，如miRNA-21在乳腺癌细胞和上皮卵巢癌细胞中的表达水平显著高于正常水平[1～3]。因此，建立快速有效的miRNA分析检测方法对肿瘤的诊断和预后有重要意义。 目前，检测miRNA的方法主要有Northern blotting法[4]、实时荧光定量PCR法[5]、原位杂交法[6]和微阵列芯片法[7]等。这些方法各有自身的优点，如实时荧光定量PCR法检测速度快、灵敏度高。然而，这些方法通常需要昂贵的试剂，对设备和操作人员要求较高[8]。相比之下，电化学生物传感器成本低、灵敏度高、特异性好、操作简单、易于小型化，具有明显的实际应用优势[9，10]。 点击化学反应是一类反应条件温和的反应[11，12]，已被用于构建传感器[13～15]。5-氨基-2，3-二氰基-1，4-萘醌（ADNQ）具有良好的电化学活性，可与3（2-呋喃）丙酸（FPA）发生点击化学反应，导致其电化学活性降低。利用此特性，本研究构建了一种基于DNA模板点击化学和催化发夹型DNA自组装反应[16～18]的新型均相电化学DNA生物传感器，用于miRNA-21的检测，检测原理如图1所示。当不存在目标物miRNA-21时，Probe-ADNQ和Probe-FPA不发生相互作用，分别修饰在Probe 1和Probe 2上的ADNQ和FPC距离较远，不能发生点击化学反应，因此Probe-ADNQ能在工作电极上产生一个良好的ADNQ的DPV特征信号。当存在miRNA-21时，miRNA-21通过碱基互补配对将Probe-ADNQ的发夹结构打开，使Probe-ADNQ茎部的碱基序列暴露出来，然后通过碱基互补配对将Probe-FPA的茎环结构打开，并将miRNA-21替换下来，使其进入下一个催化循环;在目标物miRNA-21的作用下，Probe-ADNQ和Probe-FPA通过碱基互补配对形成DNA双链，分别修饰在Probe 1和Probe 2上的ADNQ和FPC的距离被拉近，发生点击化学反应，ADNQ的分子结构被破坏，其在工作电极上产生的ADNQ的DPV特征信号降低信号降低值与miRNA-21在一定浓度范围内呈线性关系。 基于此可实现miRNA-21的定量检测。将本方法用于小鼠血液样品中miRNA-21的检测，结果表明， 本方法实用性良好。 2?实验部分 2.1?仪器与试剂 CHI660电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）。石墨烯、5-氨基-2，3-二氰基-1，4-萘醌（ADNQ）、3（2-呋喃）丙酸（FPA）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、琥珀酸（SA）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）均购自上海源叶生物科技有限公司。其它试剂均为分析纯。实验用水为超纯水（电阻率>18 MΩ cm，由上海纯浦实业有限公司超纯水仪制备）。所用缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl， 15 mmol/L KCl， 4 mmol/L MgCl2， pH=7.4）和Na2CO3-NaHCO3缓冲液（0.05 mol/L， pH=8.9）。寡聚核苷酸均由上海生物工程技术服务有限公司合成，序列见表1。 2.2?实验方法 2.2.1?Probe-ADNQ和Probe-FPA的合成?取0.28 g SA、1.36 g EDC·HCl、0.66 g NHS和10 mL DCM置于25 mL圆底烧瓶，室温下搅拌反应3 h，将DCM蒸干，用水洗涤产物，55℃烘干，得到N，N'-（丁二酰二氧基）二琥珀酰亚胺（DSS）固体。将18 nmol Probe1、4 mL Na2CO3-NaHCO3缓冲液（pH=8.9）、0.05 g DSS和4 mL二甲基亚砜（DMSO）在25 mL圆底烧瓶中混合，室温下搅拌反应4 h，用截留分子量为3000的超滤管超滤纯化。在纯化产物中加入4 mL Na2CO3-NaHCO3缓冲液（pH=8.9）、4 mL DMSO和0.06 g ADNQ，在25 mL圆底烧瓶中混合，室温下搅拌反应4 h。超滤纯化，所得的Probe-ADNQ溶于PBS（pH=7.4）， 4℃保存。 取0.5 g FPA、 1.71 g EDC·HCl、 1.03 g NHS、 10 mL DCM和0.5 mL二异丙基乙胺，在25 mL圆底烧瓶中混合，室温下搅拌反应3 h，用水洗涤，有机相用无水Na2SO4干燥后，将DCM蒸干，保留固体。将18 nmol Probe 2、 0.155 g固體产物、4 mL DMSO和4 mL Na2CO3-NaHCO3缓冲液（pH=8.9）在25 mL圆底烧瓶中混合，室温下搅拌反应4 h，超滤纯化，所得Probe-FPA溶于PBS（pH 7.4），4℃保存。 2.2.2?石墨烯纳米金复合材料的合成?将1 mg石墨烯和0.1 g抗坏血酸充分分散到10 mL水中，加入2 mL 1%（w/w）氯金酸溶液，室温下搅拌反应8 h，离心，产物分散到1 mL水中。 2.3?电化学检测 用0.05 μm氧化铝粉抛光打磨玻碳电极（d=3 mm）， 用氮气吹干，在电极表面滴涂5 μL石墨烯纳米金复合材料，50℃下烘干。 Probe-ADNQ和Probe-FPA溶液浓度均为2 μmol/L，与不同浓度的miRNA-21在Tris-HCl缓冲液（pH=7.4）中反应，反应结束后取5 μL反应液滴涂到石墨烯纳米金修饰电极的表面，50℃下烘干，于PBS溶液（pH 7.4）中用差分脉冲伏安法（DPV）采集电化学信号。三电极体系：修饰玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl电极和Pt丝电极为参比电极和对电极，扫描范围为0.60～0.15 V，扫描速度为0.1 V/s。 3?结果与讨论 3.1?传感器的可行性实验 考察了利用点击化学指示电化学传感器信号的可行性。如图2A所示，浓度较高时，ADNQ有很强电化学响应， FPA没有明显的电化学信号，ADNQ和FPA在室温下反应1 h后， 电化学响应明显降低，说明浓度较高时，ADNQ和FPA间发生点击化学反应的机率大，ADNQ的化学结构被破坏，失去电化学活性。如图2B所示，浓度较低时，ADNQ有较强的电化学响应信号，FPA没有明显的响应信号，低浓度的ADNQ和FPA在室温下反应1 h后，其电化学响应信号无明显变化，说明浓度较低时ADNQ和FPA间发生点击化学反应的机率很低，ADNQ的化学结构不易被破坏，电化学响应信号无明显降低。上述结果表明，可利用ADNQ和FPA间的点击化学反应指示电化学传感器的响应信号。 考察了采用ADNQ和FPA修饰探针指示传感器信号的可行性。如图3所示，Probe-ADNQ有较强电化学信号（图3曲线a），Probe-FPA无明显电信号（图3曲线b）。当不存在目标物miRNA-21时，Probe-ADNQ和Probe-FPA的反应混合物有较强的电化学信号（图3曲线c），说明Probe-ADNQ和Probe-FPA间不能形成双链，修饰在探针上的ADNQ和FPA距离远，不能发生点击化学反应。当存在目标物miRNA-21时，Probe-ADNQ和Probe-FPA的反应混合物电化学信号显著下降（图3曲线d）， 说明Probe-ADNQ和Probe-FPA间形成双链，修饰在探针上的ADNQ和FPA距离被拉近，发生点击化学反应。上述结果表明，可通过目标物miRNA引发Probe-ADNQ和Probe-FPA形成双链，使修饰在探针上的ADNQ和FPA发生点击化学反应，指示电化学传感器的响应信号。 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法考察目标物是否能引发Probe 1 和Probe 2形成双链。如图4所示，不存在目标物miRNA-21时，泳道e只有两个条带，且分别与泳道b和泳道c中Probe 1 和Probe 2的位置对应，Probe 1与Probe 2未形成双链;目标物miRNA-21存在时，泳道d中出现了一个新的条带，且分别与Probe 1和Probe 2对应的两个条带明亮度变暗，表明Probe 1和Probe 2形成双链。电泳实验结果表明，目标物miRNA-21可引发Probe 1和Probe 2形成双链。 3.2?实验条件的优化 探针浓度、反应时间和反应温度对传感器的检测性能有重要影响。当探针浓度过低时，miRNA-21引发Probe-ADNQ和Probe-FPA形成双链的效率低，不利于检测。如图5A所示，随着探针浓度增加，传感器响应电流ΔI增大，当探针浓度为2.0 μmol/L时，传感器ΔI趋于稳定。因此，选择最适探针浓度为2.0 μmol/L。如图5B所示，随着反应时间延长，传感器ΔI先增加，50 min后达到稳定。选择50 min为最佳反应时间。反应温度过低时，反应速率低;反应温度过高，不利于DNA链之间的杂交。如图5C所示，随着反应温度升高，传感器ΔI先增加， 30℃时ΔI开始下降。因此，选择最佳反应温度为30℃。 3.3?传感器的特异性 用本传感器分别检测0.1 nmol/L的miRNA-21、单碱基错配miRNA、三碱基错配miRNA、完全不互补miRNA的响应信号。如图6所示，单碱基错配miRNA、三碱基错配miRNA和完全不互补miRNA的检测信号都很弱，分别为miRNA-21检测信号的12.8%、 7.1%和6.9%，说明传感器具有良好的特异性。 3.4?传感器的分析性能 在最佳实验条件下，对不同浓度的miRNA-21进行了检测。以2.0 μmol/L Probe-ADNQ的信号为起始信号， 以2.0 μmol/L Probe-ADNQ、 2.0 μmol/L Probe-FPA和miRNA-21反应后的信号作为结束信号，以起始信号与结束信号之差ΔI作为传感器输出信号。如图7A所示，随着miRNA-21浓度增加（0、 0.1、 1、 10、 100、 500、 1000、 5000和10000 pmol/L），传感器DPV峰电流逐渐减小，说明miRNA-21引发probe-ADNQ和Probe-FPA形成双链的效率增加，分别标记在探针上的ADNQ与FPA发生点击化学反应的效率增加，ADNQ的化学结构被破坏，其特征电信号下降。如图7B所示，当miRNA-21浓度在0.1～1.0×104 pmol/L范圍内时，ΔI随miRNA-21浓度对数值的增加而线性增大，其线性回归方程ΔI（μA）=0.31+0.08lgCmiRNA-21 （pmol/L）， R2=0.9793，检出限为0.037 pmol/L（S/N=3）。 3.5?实际小鼠血样分析 采用传感器对小鼠全血和血清样品中的miRNA-21进行了测定，考察传感器的实用性， 小鼠全血和血清中未检出miRNA-21，标准添加实验结果如表2和表3所示。结果表明，小鼠血清中的加标回收率为92.0%～105.0%，RSD小于5.5%;全血裂解液中的加标回收率为96.0%～104.0%，RSD小于7.0%，表明本传感器实用性良好，可用于实际样品的检测。 4?结 论 构建了一种基于DNA模板点击化学和催化发夹型DNA自组装反应的新型均相电化学生物传感器，用于miRNA-21的检测。传感器不需要将探针固定在电极表面，制备简单快速;其与目标物的识别与检测发生在溶液中，位阻小，识别效率高;使用催化发夹组装放大信号，不使用酶;此传感器利用miRNA-21引发分别标记在探针上的ADNQ和FPA间的点击化学反应指示传感器信号，仅需5 μL反应液即可获得可观的信号响应。此传感器操作简单、灵敏度高、特异性好，具有良好的实际应用价值。 References 1?Croce C M， Calin G A. 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