| 标题 | 基于电喷雾-四极杆-飞行时间质谱的高聚合度人乳寡糖异构体结构解析 |
| 范文 | 李欣 李佳齐 金高娃 于龙 郭志谋 梁鑫淼 刘帅 闫竞宇 摘?要?人乳寡糖是一类存在于人乳中的天然益生元，在促进婴儿肠道菌群生长、完善免疫系统功能和抵抗病原体侵染过程中发挥着不可替代的作用。人乳寡糖的功能与其结构密切相关，但其结构组成复杂、连接方式多样，存在大量的同分异构体，且随着寡糖聚合度的升高，同分异构体的数目和复杂性都急剧增加。因此，高聚合度的寡糖异构体的结构解析是人乳寡糖研究的难点之一，对寡糖的生物功能研究具有重要意义。本研究采用电喷雾-四极杆-飞行时间质谱（ESI-Q/TOF-MS）， 在负离子模式下对分离获得的18个高聚合度人乳寡糖（其中3个为首次报道）进行了结构解析，探讨了同组异构体之间碎片离子的差异，并详细总结了寡糖异构体的裂解规律，为复杂的高聚合度人乳寡糖异构体的结构解析及新型糖结构的发现提供了科学依据。 关键词?人乳寡糖; 同分异构体; 结构解析; 电喷雾-四极杆-飞行时间质谱 1?引 言 人乳寡糖（Human milk oligosaccharides，HMOs）是人乳干物质中仅次于乳糖和脂肪，含量第三的成分，结构复杂，种类繁多，功能丰富[1～6]。研究表明，人乳寡糖在婴幼儿生长发育中起到了重要作用，主要包括：（1）促进肠道双歧杆菌等有益菌的生长; （2）可以模拟并替代宿主上皮细胞表面聚糖与肠道病原体结合，从而起到抵抗病原体粘附的功能; （3）具有调节免疫和增强肠道屏障功能的作用，进而提高宿主免疫力[1，7～12]。人乳寡糖的功能与其结构多样性密切相关，目前已报道的人乳寡糖超过200余种[2，7，13～17]。人乳寡糖由5種单糖组成，分别为葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）、岩藻糖（Fuc）及N-乙酰神经氨酸（唾液酸，NeuAc），其结构的组成方式都遵循一个基本规律（图1）：以乳糖（Galβ1-4Glc）为还原端，通过β1-3或β1-6连接的Galβ1-3GlcNAc（Type Ⅰ）或Galβ1-4GlcNAc（Type Ⅱ）单元进行延伸（最多可重复25次），形成不同的直链或分支的人乳寡糖核心结构。同时，核心结构经常被不同数目、不同连接方式的岩藻糖和唾液酸修饰，唾液酸通常以α2-3或α2-6的方式连接在半乳糖上，以α2-6的方式连接在N-乙酰葡萄糖胺上; 而岩藻糖则以α1-3的方式连接在葡萄糖上，以α1-3或α1-4的方式连接在N-乙酰葡萄糖胺上，以α1-2的方式连接在半乳糖上。当岩藻糖分别连接在N-乙酰葡萄糖胺或半乳糖上时，可以形成不同的组织血型抗原决定簇。例如，岩藻糖以α1-4的方式连接到Type Ⅰ结构中的N-乙酰葡萄糖胺上形成Lea抗原，以α1-3的方式连接到Type Ⅱ结构中N-乙酰葡萄糖胺上形成Lex抗原，以α1-2的方式连接在半乳糖上形成H抗原。除上述结构外，在人乳寡糖结构中也发现具有A/B血型抗原决定簇，即在H抗原基础上，继续连接N-乙酰半乳糖胺形成A抗原或连接半乳糖形成B抗原[2，13，14]。 人乳寡糖结构组成复杂，连接方式多样，异构体众多，为其结构解析带来了较大的挑战，并且随着寡糖聚合度增加，人乳寡糖还会出现各种分支结构，结构复杂程度进一步增加，致使高聚合度的寡糖异构体的分离和鉴定变得更加困难[18， 19]。目前，寡糖结构解析采用的方法主要包括质谱法、甲基化分析法、糖苷酶酶解法和核磁共振波谱法等[1，20，21]。其中，电喷雾-四极杆-飞行时间质谱法（Electrospray ionization-quadrupole-time of flight mass spectrometry，ESI-Q/TOF-MS）具有灵敏度高、精确度高、糖样品消耗少和无需衍生化等优点，是一种常见的寡糖异构体解析方法。Chai等[22，23]在负离子模式下，通过解析寡糖断裂产生的C、D和A型等二级碎片对人乳寡糖进行了结构分析。刘世龙等[24]和韩瑶等[25]运用此方法分别鉴定了一些中性人乳寡糖和酸性人乳寡糖的结构， 但目前多数研究仅限于对人乳中高含量且聚合度相对较低的人乳寡糖进行结构分析，对于含量较低的高聚合度人乳寡糖异构体尚未有系统的结构解析方法的报道。 本研究对分离获得的18种高聚合度人乳寡糖进行了详尽的结构解析，首次报道了3种微量的高聚合度寡糖结构，并对多组复杂同分异构体进行了区分，为复杂的高聚合度人乳寡糖异构体的解析及新型糖结构的发现提供了依据。 2?实验部分 2.1?仪器与试剂 Agilent 1290 infinity超高效液相色谱仪、6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF质谱仪（Agilent 公司）。色谱纯乙腈（Sigma Aldrich公司）; 实验用水为超纯水（Milli-Q Reference，Millipore 公司）; 寡糖样品为实验室前期分离制备的寡糖单体。 2.2?实验方法 2.2.1?人乳寡糖单体的分离制备?取适量人乳样品，采用低温离心、乙醇沉淀方法获得去脂去蛋白的寡糖总馏分[26]。一维制备色谱通过Click TE-GSH制备柱（300 mm×100 mm， 10 μm）分离得到中性寡糖、乳糖和酸性寡糖馏分[27]。二维制备色谱通过XAmide制备柱（300 mm×50 mm， 10 μm）将寡糖馏分分离，得到聚合度分别为3～9及以上的单聚合度寡糖馏分。最后，通过石墨化碳色谱柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）依次对聚合度分别为6～9的中性糖进行三维分离，获得寡糖单体[15]。制备过程中得到的馏分和单体均采用质谱测定分子量，根据图1所示的人乳寡糖组成规律和寡糖计算器软件[16]确定寡糖的聚合度和单糖组成。 2.2.2?质谱分析?将纯化样品溶于乙腈-水（1∶1，V/V）中，配制成1 mg/mL的样品溶液。流动相采用乙腈-水（1∶1，V/V），流速0.2 mL/min，进样量10 μL; 质谱条件：ESI电喷雾离子源; 负离子扫描模式; 质量扫描范围m/z 100～2000; 毛细管电压3.5 kV; Fragmentor电压75 V; 碰撞能10～45 eV; 数据分析软件Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.04.00。 3?结果与讨论 3.1?样品的选择 在前期的工作中，采用多维液相色谱从人乳中分离制备得到47个寡糖单体，其中包含多个高含量且聚合度相对较低的寡糖异构体，如LNT/LNnT、LNFP I/LNFP Ⅱ/LNFP Ⅲ、3'SL/6'SL等。这些寡糖异构体的解析已经有较多报道[22]，可以通过比对文献进行结构鉴定，但所获得的高聚合度系列寡糖异构体的结构解析鲜有报道。本研究选取了18个高聚合度中性人乳寡糖异构体进行系统研究，通过一级质谱确定其分子量，进而根据图1所示的基本规律确定其单糖组成。为方便区分各异构体，采用以分子量和后缀的方式进行命名，包括：分子量为999.36的同分异构体4个，分别命名为999-1、999-2、999-3和999-4，其单糖组成为Glc1Gal2GlcNAc1Fuc2; 分子量为1218.43的同分异构体4个，分别命名为1218-1、1218-2、1218-3和1218-4，其单糖组成为Glc1Gal3GlcNAc2Fuc1; 分子量为1364.49的同分异构体6个，分别命名为1364-1、1364-2、1364-3、1364-4、1364-5和1364-6，其单糖组成为Glc1Gal3GlcNAc2Fuc2; 分子量为1510.55的同分异构体2个，分别命名为1510-1和1510-2，其单糖组成为Glc1Gal3GlcNAc2Fuc3; 分子量为1161.41的同分异构体2个，分别命名为1161-1和1161-2，其单糖组成为Glc1Gal3GlcNAc1Fuc2。 3.2?999-1/2/3/4寡糖异构体的结构解析 此系列的4个同分异构体结构相对简单，Chai等[22]已對其进行了较全面的结构解析，可以直接通过比对文献进行归属。通过对这组异构体的解析，阐述寡糖异构体的结构解析思路，总结重要的断裂规律及特征碎片，以便于对更高聚合度寡糖异构体的结构解析。 该组异构体的组成为Glc1Gal2GlcNAc1Fuc2，没有分支结构，异构体之间的主要结构差异表现为核心结构类型（Type Ⅰ/Ⅱ）的不同及两个岩藻糖的位置异构，因此，在谱图分析中应重点关注这两点。对比各异构体的二级质谱图（文后支持信息图S1），可发现999-1和999-2（支持信息图S1A和S1B）具有相同的碎片m/z 690.3，该碎片是寡糖丢失Glc1Fuc1产生的C3碎片，证明在999-1/2中含有Fucα1-3Glc的结构。与此同时，支持信息图S1 C和S1D中无该碎片，证明999-3/4中无此结构。999-1和999-2的差异主要在m/z 348.1和m/z 364.1的碎片，分别是Lea（Fucα1-4GlcNAc）和Lex（Fucα1-3GlcNAc）产生的特征D碎片，据此可以确定999-1另外一个Fuc连接在Type Ⅰ结构中GlcNAc的4位，而999-2另外一个Fuc连接在Type Ⅱ结构中GlcNAc的3位。因此，999-1的结构序列为Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）Glc，999-2为Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）Glc。在999-3/4谱图中均含有m/z 325.1的碎片，该碎片是H血型抗原决定簇（Fucα1-2Gal）的特征C碎片，由此可知，在999-3/4结构中含有Fucα1-2Gal结构，而999-3谱图中m/z 348.1给出了另外一个岩藻糖的结构信息，由此推断999-3的完整序列结构为Fucα1-2Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc。经过对999-1/2/3的结构推断后，异构体999-4另外的岩藻糖只能以α1-3的方式连接在GlcNAc上，因此，999-4的完整结构为Fucα1-2Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，其特征的D碎片m/z 510.2证明了此结构的正确性。 采用ESI-Q/TOF-MS负离子模式对人乳寡糖进行解析时，特征碎片对于确定各个单糖之间具体的连接方式，尤其是确定Type Ⅰ/Ⅱ结构类型以及岩藻糖连接位置，具有非常重要的作用。此外，其它一些断裂规律，如3位连接键容易断裂进而产生高丰度的D碎片，而4位连接会产生低丰度的A型碎片等，都有助于对于异构体的解析。表1列出了人乳寡糖异构体常见的特征碎片，以便于下一步复杂寡糖异构体的归属及解析。 3.3?1218-1/2/3/4寡糖异构体的结构解析 在人乳寡糖的组成中，如含有两个及以上Galβ1-3/4GlcNAc（Type Ⅰ/Ⅱ）单元时，则需判断人乳寡糖的核心结构是直链，还是分支结构。1218系列寡糖异构体的单糖组成为Glc1Gal3GlcNAc2Fuc1，含有两个Galβ1-3/4GlcNAc（Type Ⅰ/Ⅱ）单元，所以应先判断此系列中的异构体的核心结构类型。通常，直链的人乳寡糖结构容易产生一系列的C断裂的碎片，根据C断裂的信息可以推测寡糖连接顺序，而分支结构则容易产生丢失3位支链结构的Dβ碎片，在此采用Chai等[23]对人乳寡糖的命名方法，将6位支链发生的断裂用α后缀表示，将3位支链发生的断裂用β后缀表示。 对比1218系列异构体的二级碎片谱图发现，异构体1218-1（图2A）含有一系列的C型碎片（C1，m/z 179.1; C2，m/z 382.1; C3，m/z 544.2; C5，m/z 1055.4），尤其是通过C3（m/z 544.2）碎片可以确定其为直链结构; 碎片0，2A2（m/z 281.1及其脱水碎片m/z 263.1）证明非还原端含有Galβ1-4GlcNAc（Type Ⅱ）结构; 通过D4-4α（m/z 729.3）可以确证Fuc连接在中间GlcNAc的3位。因此，1218-1的完整序列结构为Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc。由图2B～2D可知，都缺少一系列C碎片，并且都存在由3位支链断裂生成的D2β-3碎片，据此可确定1218-2、1218-3和1218-4是分支结构。1218-2存在明显的D2β-3（m/z 672.2）碎片，证明6位支链上含有Fuc，由m/z 364.1可确证其6位支链为Lex结构，但从谱图中仍不能判断3位支链Type Ⅰ/Ⅱ的结构。异构体1218-3和1218-4出现了完全相同的谱图，通过特征碎片D2β-3（m/z 526.2）和0，2A2（m/z 281.1/263.1）可以确定其6位结构都为Galβ1-4GlcNAc，同理，因为3位支链的信息缺失而无法判断最终结构。因此，仅通过[M-H]产生的二级碎片离子可以进行直链寡糖（如1218-1）和分支结构中6位支链的结构分析，但因缺少3位支链的具体信息而不能对分支结构的异构体进行完整结构的鉴定。 二级质谱图可以同时提供寡糖3位和6位支链所有的信息[23]，因此，通过比对 [M-H]和[M-2H]2的二级质谱图，根据新出现的碎片即可推断寡糖3位支链的信息，据此可进一步分析1218-2/3/4。与图2B相比，图3A中新出现的碎片m/z 202.1是-3GlcNAc产生的特征碎片，证明1218-2的3位支链为Type Ⅰ（Galβ1-3GlcNAc）结构。与图2C相比，图3B中新出现的碎片m/z 202.1和m/z 325.1可证明1218-3的3位支链结构为Fucα1-2Galβ-3GlcNAc。而图3C与图2D比较，根据新出现的碎片m/z 364.1， 可确定1218-4的3位支链含有Lex结构，即Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAc。1218-2、1218-3和1218-4的完整结构序列见支持信息表S1。 综上，随着寡糖聚合度的增加，寡糖异构体容易产生分支结构，需要分别通过寡糖一价离子[M-H]和二价离子[M-2H]2的二级质谱图才能解析完整结构。值得一提的是，1218-4的结构虽然在灵长类动物乳中有报道[28]，但在人乳中是第一次被确认。Lebrilla等[2]利用Chip-MS等方法也曾检测到该糖，但由于其使用方法的局限，只给出了可能的两种结构，没有给出准确的结构，而本研究通过对人乳样品系统的分离得到了该糖，并解析出其准确的结构。 3.4?1364-1/2/3/4/5/6的结构解析 1364系列的寡糖异构体与1218系列相比，组成中仅多了一个岩藻糖，结构的复杂性明显增加，且异构体的数目随之增加，各异构体[M-H]的谱图见支持信息图S2。异构体1364-1和1364-2具有一系列的C碎片（C1，m/z 179.1; C3，m/z 690.3; C5，m/z 1201.4），其中特征碎片C3（m/z 690.3）证明二者均为直链结构。高丰度的m/z 875.3显示两个异构体的结构中均有一个Fuc连接在中间GlcNAc的3位，而二者的区别在于非还原端分别为Lea和Lex。因此，1364-1的完整序列结构为Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc，而1364-2为Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc。其余4个1364异构体都含有明显的D2β-3碎片，应为分支结构。其中，1364-3与另外3个支链寡糖不同，D2-2β（m/z 526.2）证明其6位连接的是Gal和GlcNAc，通过0，2A2（m/z 281.1/263.1）可进一步确定6位支链结构为Galβ1-4GlcNAc。1364-4、1364-5和1364-6的[M-H]产生的二级谱图完全一致，根据D2β-3（m/z 672.2）和D1α-2α（m/z 364.1）碎片可以确定其6位支链寡糖的结构均为Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAc。 为确定3位支链寡糖的结构，进行了[M-2H]2二级质谱解析。对比支持信息图S3A和图S2C可知，新出现的碎片为C1β（m/z 325.1）和D1β-2β（m/z 348.1），所以1364-3的3位应为Fucα1-2Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAc。对比支持信息图S3B和S2D中新出现的D1β-2β（m/z 202.1）和C1β（m/z 325.1），可以确定1364-4的3位为Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc; 对比支持信息图S3C和S2E中新出现的D1β-2β（m/z 348.1）可以证明1364-5的3位为Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAc; 而與支持信息图S2F相比，图S3D没有出现新的碎片信息，证明该糖3位与6位支链寡糖的结构相同，所以确定1364-6的3位为Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAc。1364-3、1364-4、1364-5和1364-6的结构序列见支持信息表S1。 3.5?1510-1/2寡糖异构体的结构解析 1510系列寡糖异构体中有含有3个岩藻糖结构，结构组成更加复杂，分离纯化的难度也相应提高，因此，本系列异构体仅制备获得2个单体。异构体1510-1（支持信息图S4A）含有一系列的C碎片（C1，m/z 325.1; C2，m/z 674.3; C3，m/z 836.3; C5，m/z 1347.5），根据特征碎片C2（m/z 674.3）和C3（m/z 836.3）可以确定其为直链结构，通过特征碎片C1（m/z 325.1）、D1-2（m/z 348.1）和D4-4α（m/z 1021.4）可以确定1510-1中3个岩藻糖的位置，其完整结构序列为Fucα1-2Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAcβ1-3Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc。在异构体1510-2的[M-H]二级质谱图（支持信息图S4B-i）中出现了明显的D2β-3（m/z 672.2），证明1510-2为分支结构，由D1α-2α（m/z 364.1）碎片确定6位支链寡糖的结构为Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAc。对比[M-H]和[M-2H]2二级质谱图可知，新出现的特征碎片为C1β（m/z 325.1）和D1β-2β（m/z 348.1），可确证3位支链寡糖的结构为Fucα1-2Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAc，1510-2的完整序列结构见支持信息表S1。 3.6?1161-1/2寡糖异构体的结构解析 1161系列寡糖异构体组成与其它人乳寡糖有一定的差异性，不符合图1所示的基本规律。其分子量与999系列寡糖相差162，推断此系列寡糖组成中多了一个Gal，组成为Glc1Gal3GlcNAc1Fuc2。因此，在进行结构解析时，除确定直链或分支结构、Type Ⅰ/ Ⅱ结构类型及两个岩藻糖的连接方式外，还需判断Gal的位置及连接方式。 1161-1（圖4A）含有一系列的C碎片（C2，m/z 487.2; C3，m/z 836.3; C4，m/z 998.4），根据特征碎片C2（m/z 487.2）和C3（m/z 836.3）可以确定1161-1为直链寡糖，且m/z 348.1碎片可以确定有一个Fuc连接在GlcNAc的4位。然后推测Gal的连接位置和另一个岩藻糖的位置，m/z 487.2的特征碎片证明寡糖中含有Gal2Fuc1的结构。通常Fuc连接在非还原端Gal-1上时会产生C1（m/z 325.1）碎片，而谱图中没有出现C1碎片，证明Fuc并未连接在非还原端Gal-1上。与此同时，D1-2（m/z 307.1/247.1）的存在进一步证明Fuc连接在Gal-2上，且Gal-2与Gal-1是通过3位相连，该结构序列符合B型抗原决定基Galα1-3（Fucα1-2）Gal [14，20]。因此，推测1161-1是B型抗原寡糖，其完整序列结构为Galα1-3（Fucα1-2）Galβ1-3（Fucα1-4）GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc。 图4B-i具有与图4A明显不同的碎片，根据D1β-3（m/z 672.2）碎片可以确定1161-2为分支结构，特征碎片D1α-2α（m/z 364.1）和D1β-3（m/z 672.2）则证明1161-2的6位支链寡糖结构为Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAc; 与图4B-i相比，图4B-Ⅱ中新出现的碎片为C1β（m/z 325.1），由此确定1161-2的3位支链结构为Fucα1-2Gal。因此，1161-2的完整序列结构为Fucα1-2Galβ1-3（Galβ1-4（Fucα1-3）GlcNAcβ1-6）Galβ1-4Glc。 1161系列寡糖异构体组成上不符合人乳寡糖基本规律，结构差异较大，尚未见其它文献报道。研究者早已发现人乳寡糖中存在A/B型抗原，但报道的寡糖种类并不多，尤其是B型抗原[13，14]。1161-1结构中含有B型抗原，同时含有Leb结构; 1161-2的核心结构与目前已知的13种常见人乳寡糖核心结构不同，同时含有H抗原和Lex，此组异构体的发现进一步丰富了人乳寡糖的结构类型。 4?结 论 采用ESI-Q/TOF-MS技术对18个高聚合度人乳寡糖异构体进行了结构解析，包括分子量999和1218的同分异构体各4个，分子量1364的同分异构体6个，分子量1510和1161的同分异构体各2个。其中，3个人乳寡糖1161-1、1161-2和1218-4的结构未见报道。在负离子模式下，通过C型碎片确定寡糖的序列信息，根据D型碎片和A型碎片确定寡糖的连接方式，结合[M-H]和[M-2H]2二级质谱确定分支寡糖3位和6位支链的信息，利用特征碎片和裂解规律完成了高聚合度人乳寡糖同分异构体的结构解析，为人乳寡糖同分异构体的区分和新型糖结构的发现提供了依据。 References 1?Smilowitz J T， Lebrilla C B， Mills D A， German J B， Freeman S L. 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