| 标题 | 松材线虫与拟松材线虫杂交试验及后代繁殖力研究 |
| 范文 | 徐红梅+陈京元+汤景明 摘要：松材线虫Bursaphelenchus xylophilus和拟松材线虫B.mucronatus是伞滑刃属内两个独立的种，均可引起松材线虫病。松材线虫与拟松材线虫能否进行种间杂交在学术界一直存在争议。采用4个虫株在实验室条件下开展了杂交试验及杂交后代繁殖力研究。结果表明：实验室条件下松材线虫和拟松材线虫可成功杂交，他们之间未发展出严格的生殖隔离，二者极可能来源于同一祖先。 关键词：松材线虫；拟松材线虫；杂交 中图分类号：S763.16文献标识码：A文章编号：1004-3020（2017）03-0029-05 Abstract： As two different species in genus Bursaphelenchus，B.xylophilus and B.mucronatus can cause pine wilt disease.There has been a long running debate on whether the two species can hybridize successfully.In this study indoor hybridization were carried out with four isolates of B.xylophilus and B.mucronatus.The fecundity of their offsprings was also observed.The results showed that interspecific hybridization between B.xylophilus and B.mucronatus was possible under the laboratory condition. Cross tests showed that there was no strict reproductive isolation between them，and they were derived from a common ancestor. Key words：B.xylophilus；B.mucronatus；hybridization 松材线虫病（松树萎蔫病）被称为松树的“癌症”，是林业上的一种毁灭性病害。松材线虫是普遍认可的引起松材线虫病的主要病原物[1]。20世纪 80 年代起，中国陆续发现由拟松材线虫引起的松树萎蔫，且能造成一定的危害。近年来大量研究也证实一些拟松材线虫虫株确实有较强致病性，如对黄山松和黑松、云南松及思茅松、高山松等，并导致很多松林被毁[2-4]。因此，不少学者认为松材线虫和拟松材线虫共同构成松材线虫复合群体，为松材线虫病的病原物。 松材线虫和拟松材线虫是伞滑刃属内两个独立的种，在寄主植物、形态、生理生化等方面都极为相似。近年来，人们陆续发现形态特征、分子生物学特征及致病性方面都介于松材线虫和拟松材线虫之间的线虫群体，例如法国拟松材线虫群体以及“M”型松材线虫群体。松材线虫与拟松材线虫作为两个种的界限逐渐模糊。 由于这两个种亲缘关系很近，又经常在病木中同时存在，两个种能否杂交一直受到关注。深入研究这一问题，不仅有助于伞滑刃属线虫分类学研究，并且在松萎蔫病的流行和检疫等方面有重要的价值。 本研究在实验室条件下开展了松材线虫与拟松材线虫杂交及后代繁殖力研究，并在此基础上探讨了松材线虫和拟松材线虫在自然界是否具备杂交潜力。 1材料与方法 1.1供试线虫来源 虫株来源及编号见表1，各虫株都经过形态学和特异引物扩增详细鉴定，在分类上确认无误。 1.2PDA平板-灰葡萄孢培养 线虫的继代培养采用灰葡萄孢Botrytis cinerea作为线虫食料。将少量灰葡萄孢菌丝块接种至灭菌PDA培养基（马铃薯200 g，蔗糖20 g，琼脂17 g，蒸馏水1 000 ml）平板上，再翻转培养皿，使皿底向上，置于25 ℃恒温箱中。培养5～7 d后菌丝长满后放置4 ℃冰箱备用。 1.3未受孕雌线虫准备 将在灰葡萄孢培養基上培养的线虫用无菌水洗出，在体视显微镜下用挑针挑取单条大龄幼虫。显微镜下（×40）镜检鉴别雄虫和雌虫（雌虫阴门尚未分化，在体长约2/3处可见白色区域，雄虫则直接挑出），将雌虫放入装有2 ml无菌水的无菌微型培养皿中。挑入1～2根灰葡萄孢菌丝（饲喂线虫），25 ℃下培养2～3 d，待线虫长成成虫备用。 1.4松材线虫与拟松材线虫杂交测定 将培养好的单条未受孕雌成虫和3条异种雄成虫（正交母本为松材线虫，父本为拟松材线虫）挑入盛有灰葡萄孢菌丝块的培养皿（直径3 cm）中，让其在灰葡萄孢菌丝块上交配并繁殖；同时做反交交配组合（母本为拟松材线虫，父本为松材线虫）；以松材线虫、拟松材线虫的种内交配为对照。每个组合重复15次。25 ℃恒温暗培养，7 d后，用无菌水洗下培养皿中的所有线虫，在体视显微镜下逐一检查是否有杂交后代产生并统计杂交后代的数量，计算每个组合的交配率、平均后代数、性比和死亡率。 交配率（%）=（产生后代培养皿数/ 重复培养皿数）× 100% 平均后代数=产生后代的培养皿内的线虫数量总和/产生后代的培养皿数 死亡率（%）=（死亡总虫数/后代总虫数） ×100% 1.5杂交后代繁殖力测定 为进一步了解各杂交后代的繁殖能力，对ZJBx×FrBm、ZJBx×CBm组合的正反交后代进行继代培养，测定每代的交配率、性比、死亡率等，以ZJBx、FrBm和CBm的种内交配继代培养作为对照。取F1代培养好的1条未受孕雌虫和1条活跃雄虫继续在盛有灰葡萄孢菌丝块的培养皿（直径3 cm）中培养，做正交和反交组合，并以同种内交配产生的F1代作为对照，每个组合重复15次。25 ℃恒温暗培养，7 d后，用无菌水洗出各培养皿中的F2代，在体视显微镜下逐一检查是否有后代产生并统计后代数量，计算每个组合的交配率、平均后代数、性比和死亡率。杂交出的每一代（每隔7 d）都按此方法进行杂交和统计，直至杂交出来F5代。 1.6杂交后代同亲本回交能力测定 为了解杂交后代同亲本的回交能力，把ZJBx×FrBm、ZJBx×CBm组合的正反交后代（F1、F2）与亲本进行回交。挑取F1、F2代单条未受孕雌成虫和3条亲本雄虫挑入盛有灰葡萄孢菌丝块的培养皿（直径3 cm）中，让其在灰葡萄孢菌丝块上交配并繁殖。每个组合重复15次。25 ℃恒温暗培养，7 d后，用无菌水洗出各培养皿中的所有线虫，在体视显微镜下逐一检查是否有后代产生并统计后代数量，计算每个组合的交配率、平均后代数、性比和死亡率。 2结果与分析 2.1松材线虫和拟松材线虫杂交结果 分别对来自浙江和马鞍山的松材线虫株系和来自中国、法国的拟松材线虫株系进行种间杂交和种内交配，培养7 d后观察其F1代产生情况（见表2）。结果表明，供试的4个杂交组合（无论是正交还是反交）均有后代产生，交配率在133%～467%之间，每个组合平均后代数为11～47，F1代死亡率为158%～282%。不同杂交组合交配率、平均后代数和死亡率有所差异，中国浙江松材线虫株系（ZJBx）和法国拟松材线虫株系（FrBm）杂交组合交配率、平均后代数较高，且死亡率偏低；中国马鞍山松材线虫株系（MASBx）和法国拟松材线虫株系（FrBm）杂交组合交配率、平均后代数较低；其余组合交配率、平均后代数位于二者之间。同一杂交组合内，正交与反交的交配率、平均后代数和死亡率有所差异，总体上以拟松材线虫为母本的反交组合的交配率、平均后代数稍高于正交组合。种内交配的所有组合，交配率、平均后代数都远高于杂交组合，且后代死亡率较低。交配率在600%～100%之间，每个组合平均后代数为117～131，F1代死亡率为90%～168%。 由此可知，尽管与种内交配相比，供试杂交组合交配率和平均后代数偏低，且F1代死亡率稍高，但在实验室条件下松材线虫和拟松材线虫可以成功杂交，且杂交后代可以存活。 2.2杂交后代繁殖能力 供试的两个杂交组合（无论正交还是反交）F2至F5代繁殖能力均较强（见表3）。ZJBx×FrBm组合F2至F5代交配率在400%～800%之间，每对产生的平均后代数在27～51之间，后代死亡率为163%～221%。ZJBx×CBm组合F2至F5代交配率、平均后代数稍高，分别为467%～800%和50%～68%，后代死亡率为135%～255%。 与对照ZJBx、FrBm种内交配相比较，2个种种内交配F2至F5代交配率均高于两个杂交组合， ZJBx种内交配F2至F5代平均后代数高于两个杂交组合，死亡率相当，而FrBm种内交配F2至F5代平均后代数与ZJBx×FrBm组合相当，稍低于ZJBx×CBm组合，死亡率相当。 根据本试验结果，供试松材线虫与拟松材线虫虫株不仅在实验室条件下可以杂交，而且杂交产生的后代繁殖能力较强，F2至F5代交配率、平均后代数等均较高，后代死亡率较低。 2.3杂交后代同亲本回交能力 结果如表4所示，ZJBx×FrBm、ZJBx×CBm组合的杂交后代（F1、F2）都可以和亲本回交，交配率在在167%～667%之间，产生的平均后代数在10～35之间，后代死亡率为126%～563%。总体上来说，同一个组合内，F1代同亲本回交的交配率和平均后代数稍高于F2代，后代死亡率相当。F1（ZJBX♀×CBm♂）×ZJBX♂、F2（ZJBX♀×CBm♂）×ZJBX♂回交组合回交后代数量较少，其死亡率较高，这可能是导致回交后代雌雄比例不合理的原因，从而可以推测回交后代继续繁殖的可能性会降低，但是ZJBX♀×CBm♂、ZJBX♀×CBm♂F1、F2代同父本拟松材线虫CBm回交的交配率、平均后代数和死亡率都和其它组合相当。其它组合也表现出该特征，即F1、F2代更易和拟松材线虫回交。 由本试验结果可知，松材线虫与拟松材线虫杂交后代可以和亲本回交，F1代同亲本回交的交配率和平均后代数稍高于F2代，后代死亡率相当。F1、F2代更易和拟松材线虫回交。 3讨论 学术界关于松材线虫和拟松材线虫能否杂交及杂交后代能否存活一直存在争议，不同研究者所得出的结论各不相同。最早Mamiya用日本的3個松材线虫虫株和8个拟松材线虫虫株开展杂交研究，结果各组合均能产生F1代，但F1代都不能繁育F2代，也不能与亲本回交，因此认为松材线虫和拟松材线虫种间存在明显的生殖隔离[5]。这一研究结论不久就受到质疑。Hajaukiewicz用一个日本松材线虫株系与法国拟松材线虫株系进行杂交，发现二者具有很高的杂交潜力，杂交后代可以产生多代，且繁殖能力很强[6]。Bolla等收集了北美、日本和法国松材线虫与拟松材线虫虫株，其中不少虫株可以杂交，且F1代可繁育F2等后代[7]。Braasch用德国拟松材线虫株系与日本松材线虫株系杂交，二者能杂交并产生有致病能力的后代[8]。Riga认为松材线虫和拟松材线虫未发展出生殖隔离，在实验室条件下可成功杂交，但自然界二者不存在基因交流[9]。刘伟等研究表明有部分杂交组合产生了F2、F3等后代，通过回交也得到了可繁殖的后代，但后代数量少，认为自然界存在杂交种的可能性不大[10]。季宏铁的研究结果表明，绝大多数的松材线虫和拟松材线虫杂交产生的后代在一代或多代之后就不可再繁殖，只有法国拟松材线虫和北美松材线虫杂交才可以产生可育的后代[11]。贲爱玲等研究发现不同国家的松材线虫均能和拟松材线虫发生杂交且杂交率较高，但杂交后代较难成活[12]。纵观前人研究结果，除了Mamiya认为二者绝对不能杂交以外，其他研究尽管采用的虫株和杂交方法有所差异，但均在实验室条件下培育出了可繁育的后代。本研究中多个杂交组合均能杂交或回交成功，产生的后代大部分存活较好。 在松材线虫传入中国之前，没有拟松材线虫大面积致病的报道，早期研究亦认为，拟松材线虫不具致病性或致病性非常弱，只在松树受到恶劣环境影响或其他有害因子的危害造成松树树势衰弱时，起到加速松树枯死的作用。近几年来不断有强致病性拟松材线虫虫株报道出现并且中国有很多地区都发现拟松材线虫致使成片松林枯死。这些现象引起了笔者的关注，是否自然界存在着松材线虫与拟松材线虫的基因交流，从而导致拟松材线虫致病性增强。 从本研究结果来看，母本为拟松材线虫、父本为松材线虫的条件下种间杂交和后代数量更高。而F1、F2更容易和拟松材线虫进行回交，这表明松材线虫的基因渗入拟松材线虫更加容易，与Taga等人的研究结果较为一致[13]。这一结论似乎能一定程度上阐释拟松材线虫的致病性增强现象与松材线虫入侵后二者基因交流有关系，因此不能完全否定自然界存在着松材线虫与拟松材线虫的基因交流，今后仍需要加强相关研究。 参考文献 [1]杨宝君，潘宏阳，汤坚，等.松材线虫病（Bursaphelenchus xylophilus）[M].北京：中国林业出版社，2003：19. 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