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高效液相色谱串联蒸发光散射检测器测定梨中单双糖含量的研究

范文

王勇戴丽媛费腾赵亚坤李晓磊

摘要：为了定量测定梨果实中单双糖含量，本文以黄金梨、黄冠梨和雪花梨为研究对象，采用高效液相色谱串联蒸发光散射检测器，对梨样品中果糖、葡萄糖、蔗糖含量进行了测定。高效液相色谱条件：ZORBAX?Carbohydrate（4.6?mm?×150?mm?5μm）色谱柱，30℃柱温，流动相乙腈水（80：20v/v）溶液，流速1.0mL/min;蒸发光散射器条件：氮气流速1.8L/min，漂移管温度100℃。结果表明：在15min[KG-*7]内，测得黄金梨、黄冠梨和雪花梨果实中总糖含量分别为：15.12%、15.05%和13.78%;其中，黄冠梨、雪花梨果糖含量最高，分别占梨果实的6.52%、6.82%;其次为葡萄糖，分别占梨果实的5.08%、4.16%;蔗糖含量最少，分别占梨果实的3.44%、2.80%。而在黄金梨中葡萄糖含量最多，占梨果实的6.67%;果糖次之，占梨果实的6.32%;蔗糖含量最少，占梨果实的2.13%。

关键词：高效液相色谱;蒸发光散射检测器;梨;果糖;葡萄糖;蔗糖

中图分类号：S-3

文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20190815006

我国梨树资源丰富，广泛分布在全国各地;梨树的栽培面积和梨的产量一直居于世界第1位。梨果实中含有糖类、氨基酸、维生素、膳食纤维、矿质元素等丰富的营养成分，鲜嫩多汁，酸甜适口，因此深受人们喜爱。

梨中可溶性糖的组成和含量对梨果实的营养品质和感官品质有重要影响。不同品种梨由于生长环境、种属类别等因素的影响，糖组分也会有很大差异[1]。本文以黄金梨、皇冠梨、雪花梨为研究对象，对其中的果糖、葡萄糖、蔗糖含量进行对比。

对糖的传统测定方法主要有：化学滴定法[2]，分光光度法[2]，高效液相-示差折光法[3，4]。化学滴定法对试剂、操作过程要求严格且步骤多、操作复杂、费时，滴定终点受实验条件影响较大。分光光度法准确度高，操作简便、快速[2]，但只能测定糖的总含量，不能确定糖分的组成。

高效液相色谱仪常与示差折光检测器或蒸发散射检测器相串联，来检测糖的组分及含量。

示差折光检测器法测定存在灵敏度低，系统平衡时间较长，受温度、流速、基线噪音影响较大，且不能梯度洗脱等缺点。使用蒸发散射检测器（ELSD）作为测定方法，稳定性好、灵敏度比示差折光法高，可以很好的弥补示差法存在的缺点[1]。

所以本研究采用高效液相色谱-蒸发光散射检测法来测定3个品种梨中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量。

1?材料与方法

1.1?材料

黃金梨（新疆产）、黄冠梨（河北产）、雪花梨（河北产）均购于长春市共和果品超市;果糖、葡萄糖和蔗糖购自上海国药化学试剂公司，甲醇为色谱纯试剂，购自美国热电飞世尔科学有限公司;二次蒸馏水为自制;其他均为国产分析纯试剂。

1.2?定性用对照品溶液的配制

分别称取1.25g果糖、葡萄糖、和蔗糖对照品，置于50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，摇匀。以0.45μm孔径的微孔滤膜过滤（聚醚砜，MEMBRANA公司），吸取20μL滤液用于高效液相色谱分析。

1.3?定量用对照品溶液的配制

分别精密称取果糖、葡萄糖、蔗糖对照品1.00g，置于3个50mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度线，摇匀。作为母液备用。

将果糖、葡萄糖、蔗糖母液分别按浓度梯度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mg/mL）进行稀释。以0.45μm孔径的微孔滤膜过滤，吸取20μL滤液用于高效液相色谱分析。

1.4?样品处理及待测溶液的制备

1.4.1?样品的冷冻干燥处理

分别将3个不同品种的梨称重，切成小块，经组织捣碎机（HGB2WTS3，Waring）粉碎5min，将粉碎后的浆均匀倒入玻璃皿成2mm左右的薄层，称重，置于冰箱（Simens，博西华家用电器公司）冷冻层-20℃冷冻1h，再经过真空冷冻干燥机（FDU-2100，日本东京理化株式会社）干燥24h，快速放置于玻璃干燥器中，依次快速称重，快速用研钵磨碎用保鲜膜封存于玻璃干燥器中备用。

1.4.2?样品的烘干干燥处理

分别将3种不同品种的梨采用上述1.4.1操作冷冻1h后不进行冷冻干燥，直接在105℃的烘箱中过夜烘干，之后快速置于干燥器中，待冷却至室温，称重。

1.4.3?样品的测定

快速称取上述样品粉末0.10g于50mL容量瓶中，加入适量乙腈：水（1：1）混合溶液，在超声波清洗机中（舒美KQ-300VDE，昆山超声仪器公司）70℃，45KHz超声提取0.5h，冷却至室温后，再补充乙腈：水（1：1）定容至刻度线，并摇匀[5，6]。以0.45μm孔径的微孔滤膜过滤，所得滤液用于高效液相色谱分析。平行试验3次。

1.5?色谱条件

高效液相色谱仪（Dionex?P680?HPLC?pump，美国戴安公司）;ZORBAX?Carbohydrate色谱柱（安捷伦4.6?mm×150?mm，?5-Micron，美国）;流动相，乙腈：水（80?：?20?v/v）;流速，1.0mL/min;柱温：30℃;进样体积：20μL。

1.6?蒸发光散射检测器条件

蒸发光散射检测器（Alltech?3300?ELSD，美国奥泰公司）条件：漂移管;温度：100℃，氮气为辅气（流量：1.8L/min）。

1.7?统计分析

采用SPSS23.0统计分析软件进行数据处理。数据表示为平均值加减标准差，采用LSD法对黄金梨、皇冠梨和雪花梨的果糖含量、葡萄糖含量和蔗糖含量进行多重比较（P<0.05）。

2?结果与讨论

2.1?样品前处理条件的选择

真空冷冻干燥技术能够有效的除去水分，且经该技术处理的样品营养成分损失少[7]。所以，本研究采用真空冷冻干燥法对样品进行处理。

经真空冷冻干燥后的黄金梨、黄冠梨、雪花梨失去的水分占总质量的比值，分别达83.66%、87.77%和87.66%。经105℃过夜烘干后的样品黄金梨、黄冠梨、雪花梨失去的总水分占总质量，分别达84.66%、89.01%和89.68%。从中可以看出，烘箱干燥处理的样品失水量比真空冷冻干燥稍大，但差别保持在2.5%之内。且烘箱干燥处理后的样品由于高温处理，样品发生了褐变，糖组分及含量的变化影响了样品中糖含量的测定。而真空冷冻干燥处理的样品可以有效除去水分，其他营养成分损失少。所以本研究采用真空冷冻干燥处理样品。

梨中主要糖分果糖、葡萄糖、蔗糖都易溶于水，升高温度可以提高糖的溶解度。使用超声提取法用乙腈：水（1：1）溶液浸提样品中糖分，可以使糖分子充分浸出，防止梨中糖分未完全浸出而带来的误差。所以本实验采用浸提温度为70℃，超声时间0.5h[8]。

2.2?标准曲线的制定

将1.2中高效液相色谱分析结果得出的3种糖标准谱图，按上述1.5色谱条件测定峰面积。分别以果糖、葡萄糖、蔗糖梯度浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，回归方程及相关系数见表1。3种糖的标准谱图详见图1、图2、图3。从3种标准品的谱图中可以看出3种糖在15min内全部出峰，果糖最先出峰，在7.098min，葡萄糖在8.148min出峰，蔗糖出峰时间最迟，在11.747min。

2.3?样品色谱图

按照1.5色谱条件对3种不同品种的梨中果糖、葡萄糖、蔗糖进行测定，样品色谱图如图4、图5、图6所示。

用高效液相色谱分离3种糖的样品谱图结果表明，本试验所采用的色谱条件可以很好地分离果糖、葡萄糖和蔗糖。3个样品谱图中果糖出峰时间最早，在7.549min左右，葡萄糖出峰时间在8.512min左右，蔗糖出峰时间最晚在12.321min左右，达到了基线分离效果，色谱基线稳定。比较果糖、葡萄糖和蔗糖标准品的谱图，可以看出，样品的出峰时间比标准品的出峰时间稍晚一些。

宋晓晖[1]和姚改芳[9，10]的研究结果表明，梨果实中主要糖分为果糖、葡萄糖和蔗糖。与本试验得出的结果一致。姚改芳[9]的研究中，采用高效液相-示差折光检测器测定梨果实样品色谱图中3种糖的出峰顺序依次为蔗糖、葡萄糖、果糖;与本研究采用高效液相-蒸发光散射检测器检测法测定梨样品中3种糖的出峰顺序不同。宋晓晖等[1]的研究，采用高效液相-蒸发光散射器测定样品梨果实中糖含量，为了使梨样品色谱图中山梨糖醇和葡萄糖达到更好的分离效果，分别在不同柱温、流动相流速和流动相比例条件下，测定梨样品色谱图。而本研究确定的色谱条件，色谱图中不会检测到山梨糖醇，从而避免了山梨糖醇对葡萄糖的影响。

2.4?精密度实验

分别将果糖、葡萄糖、蔗糖对照品配制成浓度为0.08、0.08、0.04mg/mL的溶液，以0.45μm孔径的微孔滤膜过滤，吸取适量滤液用于高效液相色谱分析，按上述1.5色谱條件测定峰面积，外标法定量计算果糖、葡萄糖、蔗糖浓度的相对标准偏差（RSD，n=6），相对标准偏差（RSD）均小于2.7%。故使用HPLC-ELSD法测梨中果糖、葡萄糖、蔗糖精密度较好。详见表2。

2.5?3种梨样品中果糖、葡萄糖、蔗糖的含量

分别取3个品种的梨样品，按上述1.4方法处理后，以上述1.5色谱条件平行测定4次（n=4），结果详见表3。

从表3中可以看出，黄金梨、黄冠梨、雪花梨中均含有大量果糖、葡萄糖、蔗糖。黄冠梨、雪花梨果糖含量最高，分别占梨含量的6.52%和6.82%;其次为葡萄糖，占梨含量的5.08%和4.16%;蔗糖含量最少，占梨含量的3.44%～2.80%。而在黄金梨中葡萄糖最多，占梨含量的6.32%;果糖次之，占梨含量的6.32%;蔗糖含量最少，占梨含量的2.13%。3种梨中总糖含量由小到大以此为：雪花梨、黄冠梨、黄金梨。3种不同品种的梨果糖含量无明显差异，葡萄糖、蔗糖含量有显著差异，这可能是由于梨的品种及其生长地、日照时间、气候条件、人为施肥程度、成熟度等因素造成的。

结果表明，黄金梨属于高果糖、高葡萄糖型，这与宋晓晖等人[1]的研究中新疆梨属于高果糖、高葡萄糖型相一致。黄冠梨果糖含量最高，蔗糖含量最少，属于高果糖型;宋晓晖等[1]的研究结果：黄冠梨中果糖占总糖含量最高，达30%左右，蔗糖占总糖含量最少达8.69%左右，属于高果糖、低蔗糖型。雪花梨果糖含量最高，属于高果糖型，蔗糖含量最低;高海洋等[11]的研究结果：雪花梨梨汁中果糖含量最高，可达70.49g/L，蔗糖含量最低，达1.638g/L，说明雪花梨为高果糖、低蔗糖型。这表明本实验以黄金梨、皇冠梨和雪花梨为材料，分析处理得出结果与他人研究得出的结果相一致。

3?结论

对3个不同品种梨利用组织捣碎机磨成果浆，然后采用真空冷冻干燥技术预处理，乙腈：水（1：1）超声波提取果糖、葡萄糖和蔗糖，再利用HPLC-ELSD法进行定量分析，结合SPSS统计分析软件，通过差异性可以准确的分析出梨中可溶性糖的组分（主要为葡萄糖、果糖和蔗糖）、含量和不同品种梨中同种糖的差异性比较。本实验采用的方法可用于梨中糖含量的质量分析与控制，具有实用价值。

参考文献

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[10] 姚改芳，张绍铃.10个不同系统品种的可溶性糖与有机酸组分含量分析[J].南京农业大学学报，2011，34（5）：25-31.

[11] 高海燕，王善广.不同品种梨汁中糖与有机酸含量测定及相关性分析[J].华北农学报，2004，19（2）：104-107.

作者简介：

王勇（1993-），男，在读硕士研究生。研究方向：食品生物技术。

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