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核桃国内外主栽品种种质资源搜集及DNA提取保存

范文

王晶李建史根生

摘要：本研究搜集了211个国内外核桃主栽品种，采集了核桃品种的枝条，并对采集的品种枝条的芽进行嫁接，试验在山西省农业大学经济作物研究所核桃资源圃内进行，建立引种档案。取当年新生枝条的顶端嫩叶，进行核桃品种DNA的提取，并于山西省农业大学园艺实验室-80℃冰箱内保存。

关键词：核桃;引种;DNA提取

中图分类号：S-3 ? ? ? 文献标识码：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200930010

核桃（Juglans regia L.）属胡桃科核桃属，是核桃属中栽培最为广泛的种。核桃是一种果材兼用的落叶树种，在我国核桃的栽培历史悠久，种植资源丰富，形成了众多特异优良的地方品种。我国核桃的分布很广，辽宁、天津、北京、河北、山东、山西、陕西、宁夏、青海、甘肃、新疆、河南、安徽、江苏、湖北、湖南、广西、四川、贵州、云南及西藏等21个省份都有分布。

核桃是重要的坚果和木本粮油树种，位列世界4大干果（核桃、扁桃、腰果和榛子）之首。核桃被医学界公认为抗衰老食品，并素有“长寿果”的美誉。核桃仁中富含蛋白质、脂肪、纤维素、维生素等营养元素，含有最适宜人体健康的ω-3脂肪酸、褪黑激素、生育酚和抗氧化剂等，可有效减缓和预防心脏病、癌症、动脉疾病、糖尿病、高血压、肥胖症和临床抑郁症的发生。

地方品种是在特定地区经过长期栽培和自然选择而形成的品种，对所在地区气候和生产条件一般具有较强适应性，并含有丰富的基因型，具有丰富的遗传多样性，常存在特殊优异的性状基因，是果树品种改良的重要基础和优良基因来源。所以，搜集地方核桃品种资源是非常有意义的。

1 核桃品种的枝条采集及保存

1.1 枝条采集

在山西省、东北省、山东省、河南省、陕西省、河北省等核桃主要种植省份，采集了211个品种，具体采集信息见表1。将采集的品种枝条用湿布包裹运回基地，嫁接于优质的实生核桃品种上。

1.2 嫁接

于2020年6月，选择长势良好的实生核桃树木，将引入的核桃品种芽嫁接，保存品种。

1.2.1 选砧木

选用生长旺盛、无病虫害的1～2a的实生苗，要求距地面5～6cm处的直径在0.5cm以上。芽接前10d左右，将选定的砧木下部距地面7～8cm以上的分枝剪去，以便于操作。

1.2.2 选削接穗

选要取样品种健壮、丰产、无病虫害的中年核桃树冠外围部位，选取叶芽饱满的当年生发育枝。选好枝条后，剪除叶片，只留叶柄。左手拿好枝条，右手持芽接刀，先在枝条上选定1个芽，在选定的叶芽上方0.5cm处横切1刀，然后用刀自下端横切处紧贴枝条的木质部向上削去，一直削到上端横切处，削成1个上宽下窄的盾形芽片接穗。为了保持接穗的湿度，可将接穗含在口里或用湿布盖好。

1.2.3 切砧木

在砧木的北边距枝底2～3cm处横切1刀，长约1cm，深度以切断砧木皮层为度，再从横口中间向下垂直切1刀，长约1～1.2cm，切成T形。然后用芽接刀骨柄挑开砧木皮层，以便插进接穗。

1.2.4 插接穗

用芽接刀挑开砧木上的T字形切口，将接穗插入切口中，插入时接穗的叶柄要朝上。插入后，要使接穗上端同T字形横切口对齐，如果接穗过长，可自上端切去一些。

1.2.5 绑缚

用塑料袋或其它绑缚材料，先从接口上边绑起，逐渐往下缠，叶芽和叶柄要留在外边。

1.2.6 接后管理

接后3～4d要检查嫁接是否成活。如果接穗的叶柄用手轻轻一碰立即脱落，接穗皮色鲜绿，说明已经接活;如果叶柄不落，接穗干枯，即没有接活，需要补接。成活10d后，要将绑缚解除，以免阻碍结合部位生长。在此以后，要进行剪贴。夏季接的要在当年剪砧。剪砧的位置是在T字形横口上方2cm左右。当接穗萌发长到一定高度时，应在一旁插1个支柱，将接穗枝条绑缚在支柱上，使接穗枝条直立生长，并可防止被风吹折。

1.3 建立引种档案

用卡片登记核桃品种的详细农艺特性，并装订成册，建立引种档案。

2 核桃品种的DNA提取及保存

2.1 核桃品种DNA提取

剪取0.2～0.3g新鲜叶片于2mL离心管中（刚好淹没管底），迅速放入液氮罐中，在管盖及管壁上标注好样品名称。采样结束回到实验室后，用镊子将2mL离心管夹出，向管内加入3mm钢珠2粒，再次放入液氮桶中。将2mL离心管置入430组织破碎仪样品板中，液氮浇在样品板上，使样品保持速冻状态，待液氮消散，将样品板置于组织破碎仪中振荡破碎3min。需注意，2块板中的样品要对称放置。

破碎结束后，加入2×CTAB 1000μL，将离心管放入浮板置于65℃水浴中2h;水浴过程中隔0.5h颠倒混匀1次;插入浮板后，浮板位于离心管中部靠上位置，既能使下部充分水浴，也能防止上部由于管口未盖紧而浸入水。

水浴后，待离心管冷却至室温，加入24∶1氯仿-异戊醇800μL，轻柔颠倒混匀，静置15min，4℃12000rpm·min-1离心15min，吸取上清至新管中。若上清不够澄清，重复上一步骤。

加入-20℃预冷的无水乙醇1200μL，轻柔颠倒混匀，-20℃条件下放置20min，4℃ 12000rpm·min-1离心15min，去掉上清;若-20℃空间不足，也可放置于-40℃中;离心后管底可以观察到白色絮状沉淀。加入75%乙醇800μL，颠倒混匀，4℃ 12000rpm·min-1离心15min，去掉上清。將离心管插到浮板上开口斜放，过夜干燥直到沉淀透明。

2.2 溶解核桃品种DNA及浓度检测

加入TE buffer100μL及2‰RNase，4℃条件下静置溶解4h;若短期内可做完使用ddH2O溶解，长期保存使用TE buffer。使用NanoDrop Spectrometer测定DNA浓度及纯度。使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。

2.3 制备核桃品种DNA工作液

DNA浓度稀释至50ng·μL-1左右（标准浓度），260/230最低不要低于1.3，否则PCR及PAGE效果很差。

A 260nm：核酸最高吸收峰的吸收波长;A 280nm：蛋白质最高吸收峰的吸收波长;A 270nm：酚的最大吸收峰;A 230nm：碳水化合物最高吸收峰的吸收波长。

纯DNA的260/280一般在1.8左右，大于1.9表明有RNA污染，小于1.6表明有蛋白质、酚等污染。

2.4 核桃品种DNA保存

稀释好的DNA样品放入置物盒，标号存档，置于-80℃冰箱保存。

参考文献

[1] 高焕章，赵振军，蔡法律，向一兵，税玉成，何玉枝，王进.湖北核桃种质资源分析[J].长江大学学报（自科版），2013，10（17）：8-10，14.

[2]袁海涛，董玉芝，王肇延.用最小距离逐步取样法构建野核桃核心种质[J].浙江农业科学，2012（07）：972-974.

[3]张力思，陈新，徐丽，魏海蓉，刘庆忠.核桃种质资源工作现状与展望[J].落叶果树，2017，49（06）：18-22.

[4]王红霞.我国核桃种质资源及育种研究进展[J].河北林果研究，2007，22（04）：387-392.

（责任编辑 ?李媛媛）

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