| 标题 | 种质资源超低温保存技术及其在草莓中的应用研究进展 |
| 范文 | 连朋 王丽娟 摘 ? ?要：植物种质资源是最重要的自然资源之一，也是植物育种的基础。因此，研究植物种质资源保存技术对维持物种多样性具有重要的现实意义。种质资源超低温保存技术是指植物材料在液氮（-196 ℃）超低温环境中可以长期保存，以保持其遗传稳定性。本文对植物种质资源超低温保存技术的起源、研究现状、保存原理、具体方法、影响因素以及保存时间进行了归纳总结，并概述了其在草莓种质资源保存、脱毒苗培育及草莓再生苗遗传稳定性方面的应用，提出其在发展的过程中冻存机理、材料冻存前后生理状态和普适性技术体系方面的研究有待于进一步深入的观点，并指出其在材料脱毒、抗性育种和遗传转化方面的广阔发展前景，旨在为该技术在植物种质资源保存方面的深入研究和进一步拓展应用提供参考。 关键词：种质资源;超低温保存;草莓;研究进展 中图分类号：S668.4; S325 ? ? ?文献标识码：A ? ? ?DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.10.002 Abstract： ?Plant germplasm resources are one of the most important natural resources and the basis of plant breeding. Therefore， it is of great practical significance to study the conservation technology of plant germplasm resources to maintain species diversity. The cryopreservation technology of germplasm resources refers to the long-term preservation of plant materials in liquid nitrogen （-196 ℃） cryopreservation environment to maintain their genetic stability. In this paper， the origin， research status， preservation principle， specific methods， influencing factors and preservation time of cryopreservation technology for plant germplasm resources were summarized， and its application in preservation of strawberry germplasm resources， cultivation of virus-free seedlings and genetic stability of regenerated strawberry seedlings were summarized. It was pointed out that the research on freezing mechanism， physiological state and universal technical system of materials before and after freezing need to be further deepened， and that it had broad prospects for development in material detoxification， resistance breeding and genetic transformation. The paper is to provide reference for further research and application of this technology in plant germplasm conservation. Key words： ?germplasm resources; cryopreservation; strawberry; research progress 植物種质资源是指包含各种遗传物质的植物总称，又被称作遗传资源或品种资源，包括栽培种、野生种和人工培育的各种植物的品种或品系[1]。随着科学技术不断进步，工业、农业、制造业需求不断增长，人类掠夺式开采自然资源的方式严重威胁着植物种质资源的保存，目前全球有近十万种植物（超过世界植物种类的1/3）濒临消失的边缘，我国约有15%的植物濒临消失，并且全球气候变暖使这种状况更为恶化[2]。据估计，过去的3个世纪，物种绝迹速度被人为地提高了1 000多倍，大部分城市地区和栽培作物原产地的野生资源及其近缘种都濒临绝迹[3]。 植物种质资源保存方法分为3种：传统保存法、离体保存法和超低温保存法。传统保存法分为原生境保存和异生境保存两种[4]，可以较好地保存一些稀有或者即将灭绝的物种以及一些人们需求的特有物种，有助于人们对这些植物种质资源的开发和使用，但需要大量的土地和人力资源，消耗的成本较高，并且容易遭受各种病虫害和自然灾害的侵袭。离体保存法是利用植物细胞的全能性以及组织培养技术获得细胞、组织、器官特定培养材料，通过改变培养材料生长的外部环境条件，使其生长速度降至最低限度，以达到保存种质的目的[5]，离体保存的材料不仅需要按期继代，而且可能会发生染菌和褐化现象导致材料失活[6]，另外随着培养时间的增加保存的材料可能会发生遗传变异[7]。超低温保存法一般是在液氮（-196 ℃）的超低温条件下保存植物细胞、组织或器官，经过超低温保存的植物材料能保持正常的细胞活性、全能性和遗传稳定性，从而达到长时间保存种质资源的目的[8]。 本文主要从保存原理、研究现状、具体方法、影响因素、保存时间几个方面对植物种质资源超低温保存技术进行归纳总结，并对其在草莓种质资源保存中的应用进行概括，旨在为该技术在植物种质资源保存方面的深入研究和进一步拓展应用提供参考。 1 种质资源超低温保存技术 1.1 原理及现状概述 植物种质资源超低温保存指的是将植物的器官、细胞等材料置于液氮（-196 ℃）中使其始终处于超低温的环境下进行保存的技术[9]。处于超低温保存的植物材料暂停一切新陈代谢活动，经过解冻和恢复培养该材料再次具有正常细胞的生理活性和遗传稳定性。在这一变化过程中，冻存的细胞内化学成分没有发生本质性改变，仅在物理结构方面发生变化，不会改变细胞内遗传物质以及相关代谢功能，因此在植物材料解冻后仍然能够保持普通细胞的正常生理活性及遗传稳定性，防止因长期继代培育而造成的基因突变和染色体变异等，从而可以实现安全、有效的长期冻存植物材料[10]。 超低温保存是目前唯一可以长期保存植物种质资源且不需要继代培育的成本较低的技术，甚至被认为是实现植物种质资源长久、稳定保存的唯一途径[11]。该技术的发展起源于对冷冻保护剂作用的了解，其保存过程中植物细胞需经历剧烈的降温和升温变化，故超低温保存成功的关键是避免降温过程中细胞内冰晶生成以及温度改变对细胞膜系统和代谢酶活性的影响[12]。1949年Polge发现甘油可以减轻超低温对鸟类精子的冻存破坏，1959年二甲基亚砜（DMSO）开始被作为冰冻保护剂[13]。Nag等[14]于1973年首次报道了利用超低温保存技术成功冻存萝卜悬浮细胞的研究。自此以后，经过近四十年的探索和发展，从开始相对落后的快速降温冷冻法、逐渐降温冷冻法[15]，至1981年Fahy首次提出植物细胞玻璃化（即在比较慢的冷却速率下利用高浓度的冷冻保护剂溶液使植物细胞进入玻璃化状态）的概念[16]，提升发展为玻璃化法[17]、包埋玻璃化法[18]、小液滴玻璃化法[15]等，使超低温保存技术日趋完善。截止到2018年，我国已建成1座国家种质资源长期库、1座复份库、10座中期库及种质资源信息系统，保存48.1万余份的种质资源，保存数量位居世界第二，为作物科学和遗传育种提供了雄厚的物质基础[19]。 1.2 方 法 目前，植物茎尖、芽和分生组织的超低温保存方法主要有如下5种[20]。 1.2.1 慢冻法 也称为二步冷冻法，以缓慢的速度连续降温到-196 ℃，或者将材料以0.5～2.5 ℃·min-1的降温速度持续降温到-30～-40 ℃，然后再将茎尖直接浸没液氮中;或者在-30～-40 ℃预冻一段时间，然后再将茎尖浸没于液氮中。 1.2.2 快冻法 ? ?即在预处理温度下，将材料径直浸没于液氮冻存。 1.2.3 包埋脱水法 ? ?首先是将材料用海藻酸钙包埋，然后将包埋后的保存材料放在含有高浓度的培养基上进行预培养，之后用通风设备或硅胶对包埋小珠进行干燥脱水处理后投入液氮冻存。 1.2.4 玻璃化法 ? ?在材料经过预培养后，用高浓度的玻璃化液在常温或0 ℃条件下进行加载处理和脱水处理，然后再将茎尖浸没于液氮中冻存。 1.2.5 包埋玻璃化法 ? ?先是用海藻酸盐包埋材料，然后用玻璃化液进行诱导脱水，最后将其直接浸没于液氮冻存。 1.3 影响因素 超低温保存材料能否成功是由材料特性、预培养方法、冷冻保护剂、冷冻方法等因素共同决定的[9]。 1.3.1 材料特性 ? ?因植物种类不同其基因型不同，同一植物的不同部位或者相同植物相同部位的不同大小其生理活性也不同，导致冷冻成效差别较大，因此植物材料的选择非常重要[21]。例如超低温保存苹果茎尖时，6周龄时成活率只有27% ，而29周龄时成活活率达到86%[22-23];张玉芹等[24]研究发现，体积较小的百合组培球茎尖冻存成活率比较高但之后的恢复培育比较难，而体积较大的百合组培球茎尖成活率较低但之后的恢复培育较为容易。 1.3.2 预培养方法 ? ?主要目的是减小细胞内自由水含量，有低温锻炼和干燥处理两种方法[9]。低温锻炼可提高细胞液的渗透势和植株内的α-亚氨基酸和聚胺的浓度，增强材料细胞的抗寒性，故预培养可在相当程度上增加植物材料的成活率[25]。陈加利等[26]通过对不同低温锻炼时间对扁桃茎尖存活率的影响进行研究，结果表明，以4周这个时间点为界限，随着低温（4 ℃）锻炼时间的延长，扁桃茎尖经过超低温保存后的成活率呈现先增加后下降的变化趋势，而扁桃茎尖没有经过低温锻炼就进行超低温保存，其成活率为0。干燥处理是使植物细胞的含水量居于一个合适保存水平，防止植物材料细胞内的水分在冷冻过程中生成冰晶对植物造成破坏[27]。 1.3.3 冷冻保护剂 ? ?可以在一定程度上减少超低温对植物材料造成的伤害，冷冻保护剂可以分为渗透保护剂和非渗透保护剂[28]。渗透保护剂有甲醇、乙二醇、丙二醇、甘油、二甲基亚砜等化学试剂，分属小分子物质，容易穿过细胞膜和细胞液中的水分子融合，可阻止冻存材料在冷冻和化冻时因过度脱水而死亡[29]。其中二甲基亚砜自身就为毒性物质，用保护剂处理材料时会对其在一定程度上造成伤害，所以在超低温保存时应合理选择冷冻保护剂的种类和用量，及其处理的时间和温度，否则冷冻保护剂就起不到应有的保护作用[30]。非渗透保护剂有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇等，分属大分子物质，不能穿过细胞，但在超低温保存之前，能优先融合溶液中的水分子[29]。 1.3.4 冷冻方法 ? ?不同的冷冻方法具有不一样的降温速度，而降温速度的快慢又会影响超低温保存后植物材料的成活率，所以不同植物材料的最优降温速度又不一样，器官水平上的植物材料则由植物實现低温锻炼的强度决定冷冻方法，细胞水平上的植物材料主要由细胞膜的通透性能决定冷冻方法[25]。 1.3.5 解冻方法 ? ?超低温保存有冷冻和解冻这两个急速变温的过程，不仅要选择适宜的降温冷冻方法，还要选择合适的升温解冻方法，阻止植物材料在升温过程中细胞内溶液发生二次结冰现象，以及细胞在升温回暖过程中吸水的渗透作用对细胞膜造成破坏[31]。目前，应用较多的解冻方法有常温自然解冻、常温水浸泡解冻和水浴加热解冻3种，应根据不同的冻存材料，选择不同的合适的解冻方法[32]。 1.4 保存时限 理论上超低温保存技术可以“无限期”地保存植物种质资源。1903年瑞典物理化学家Arrhenius研究了温度对化学反应速度的影响，发现低温能有效降低生物生化反应速度，并得出了Arrhenius关系式：K=A×exp（-Ea/RT），式中，K为反应速率，R为气体常数，T为绝对温度，Ea为活化能，A为Arrhenius因子（常数），计算出生物材料在液氮（-196 ℃）下可保存上百年[33]。 Ozkavukcu等[34]报道了经超低温保存50年的牛精子解冻后的生理活性及其功能没有发生太大变化;Caswell等[35]报道了经过超低温保存28年的豌豆和草莓茎尖恢复再生成功;Walters等[36]报道了苹果休眠芽经超低温保存20年嫁接后仍能成活。但是目前对于超低温保存技术研究时间尚短，所以其所能保存的极限时间需要更长的研究时间来验证。 2 超低温保存技术在草莓植物中的应用 2.1 草莓种质资源现状 2.1.1 野生品种资源 ? ?野生草莓在抗逆性、抗病性、独有香气和赏识性等很多方面拥有独特的优点，可以用作抗性育种的亲本[37]。1962—2009年，德国学者Staudt[38]考查了亚洲、欧洲和美洲的野生草莓品种资源，并对从世界各地采集的草莓属植物样本进行了比较研究，归纳解决了草莓属植物品种分类中存在的同种异名问题，完善了草莓品种的划分体系，认为全球大概有24种草莓属植物，绝大多数草莓种均为野生或半野生状态[39]。Hummer等[40]在德国学者Staudt的分类基础上增加了一个五倍体草莓种，即布氏草莓（Fragaria×bringhurstii Staudt），并且首次发现了天然的十倍体草莓种。 我国是世界野生草莓的发源地之一，亦是野生草莓资源种类最富饶的国家之一，拥有约14个野生草莓品种，主要分布在西南、西北和东北地区，这些地区都是野生草莓种质资源纯天然的基因库，生长着种类繁多的野生草莓品种，保存着很多的种、变种和类型，是宝贵的草莓种质资源[39，41]。1981年起，我国着手建造国家果树草莓种质资源圃，对我国分散的野生草莓资源进行了考察收集与保存，其中以沈阳农业大学相关工作最为突出，是世界上收集保存野生草莓品种最多的单位之一，至2010年累计收集保存国内外野生草莓种质资源285份，为我国野生草莓种质资源保存和分类使用研究奠定了根基[42-43]。据统计，目前全国共收集保存的野生草莓、本地栽植品种、国外引进栽植品种、培育的新品种等草莓种质资源大概有1 000余种[44]。 2.1.2 栽培品种资源 ? ?世界上最早栽植草莓的国家是法国，其早在14世纪时就有栽植草莓的历史记录，当时栽植的是原生于欧洲的野生种草莓，果轻且品质不好[39]。1750年，欧洲培育出弗州草莓与智利草莓的天然杂交种草莓即凤梨草莓（Fragaria×ananassa Duch. ex Lamarck），由于其果形气味均与凤梨相似而闻名，凤梨草莓是近代现有草莓栽培品种的祖先[45]。全世界现有的草莓栽培种类多达2 000多种，并且仍在不断培育出新品种[39]。 我国利用野生草莓资源进行种间杂交育种事业起步较迟，栽植品种资源主要有国内自行培育的品种以及从国外引进的欧美品种和日本品种[46-47]。我国的草莓育种大体可分为3个阶段：第1阶段为20世纪50年代，由江苏省农业科学院和沈阳农业大学领头实施的实生选种阶段，培养出的品种有‘紫金、‘五月香等;第2阶段为80年代末期到90年代末期，由原本的2家育种机关发展到8家育种机关，而且育种方法也逐渐从实生选种改变为杂交育种;第3阶段为21世纪至今，草莓育种进入到了极速进展阶段，目前已经育成了约有 119 个草莓品种[48]。 2.2 超低温保存技术在草莓种质资源保存上的应用 Caswell等[35]从草莓试管苗培养物分离出分生组织，用低温保护剂处理，缓慢冷冻至-40 ℃后并于1979年储存在液氮中，2007年解冻91个样本进行体外培养，其成活率（59%）与原始研究报告中1979年冷冻保存8周后的成活率（56%）差别不大，这是目前所有关于草莓超低温保存研究中唯一保存时间最长且成活率高于50%的报道。 Yamamoto等[49]对15个草莓品种进行了铝冷冻板玻璃化法超低温保存研究，结果表明，将草莓匍匐茎在5 ℃先进行3周冷驯化，切取1.5～2.0 mm茎尖于2 mol·L-1甘油和0.3 mol·L-1蔗糖培养基上在5 ℃培养2 d，然后用海藻酸钠凝胶包埋，25 ℃在加载液中浸泡30 min，之后再PVS2中浸泡50 min，保存于液氮中，解冻后将附在冷冻板上的茎尖直接浸入2 mL1 mol·L-1蔗糖溶液中进行再生，得出15个草莓品种茎尖超低温保存后平均再生率达到了81%。 Hofer[50]对107个栽培种草莓和20个野生种草莓品种（50份）的基因型谱进行了综合测定并对其玻璃化法超低温保存技术进行了研究。结果表明，将草莓匍匐茎进行14 d低温驯化（-1 ℃，16 h黑暗;22 ℃，8 h光照），然后切取茎尖（1～2 mm）进行DMSO预培养、冰上PVS2玻璃化、液氮保存、恢复培养，得出栽培种草莓和野生草莓平均再生率分别为89.55%和85.50%，该技术被应用为德国国家草莓基因库183個草莓品种和德累斯顿-皮尔尼茨新野生草莓基因库收集的270个草莓品种的超低温保存标准化技术。 2.3 超低温保存技术在草莓脱毒苗培育上的应用 罗娅等[51]利用超低温保存技术对‘红颜草莓进行脱毒苗的培育，结果表明，在含0.3 mol·L-1预培养基上暗培养7 d，室温下LS（加载液）装载60 min，0 ℃下PVS2脱水1 h，液氮处理1 h，40 ℃水浴化冻120 s，用含1.2 mol·L-1蔗糖的液体MS培养基洗涤2次，获得脱毒苗的再生率为69.03%，利用RT-PCR病毒检测体体系检测出脱毒苗中不含草莓4种主要病毒（草莓皱缩病毒、草莓斑驳病毒、草莓镶脉病毒和草莓轻型黄边病毒），即获得的‘红颜草莓脱毒苗脱毒率达到了100%。 陈曦等[52]以‘福莓1号草莓茎尖为材料，对玻璃化法超低温保存技术进行了研究，结果表明，外植体低温锻炼2 周、茎尖暗培养3 d，1/2浓度PVS2溶液及全濃度PVS2溶液0 ℃进行2次处理，液氮冷冻保存1 h以上，40 ℃的水浴中快速解冻2 min，卸载后茎尖先暗培养3 d后转入正常光照培养，再生培养成活率约30%，4种主要病毒的脱除率为100%。 2.4 超低温保存后草莓再生苗遗传稳定性分析 朱文涛[53]以野生种‘五叶草莓和携带草莓轻型黄斑病毒的‘全明星草莓为材料，研究了超低温保存的最佳条件、超低温脱除草莓轻型黄斑病毒的效率、超低温保存后草莓基因组DNA序列的稳定性以及基因组DNA甲基化的变化水平。结果表明，草莓组织培养材料在4 ℃条件下低温炼苗3周，切取2～3 mm的离体茎尖，4 ℃下在固体预处理培养基中培养3 d，25 ℃下液体预培养液浸泡30 min，20 ℃下PVS2处理1 h时，‘五叶草莓和‘全明星草莓成活率分别达到79.7%和64.3%，采用扩增片段长度多态性（AFLP）技术分析了超低温前后的‘五叶草莓和‘全明星草莓的基因组DNA序列，没有发现多态性差异条带，即经过超低温之后的草莓植株基因组DNA序列稳定，但是‘五叶草莓和‘全明星草莓基因组DNA甲基化水平分别降低了6.73%和3.83%。 3 超低温保存中存在的问题及前景展望 超低温保存技术是目前种质资源长期保存的理想方法，已成功应用于上百种植物，随着超低温保存技术的发展，可保存材料范围不断扩大，材料保存时间也不断延长。但是，目前对超低温保存的研究多侧重于验证某种植物的超低温可贮性，以及保存技术的研究，对冻存机理以及材料冻存前后生理状态的研究尚不深入。此外，该技术尚未形成普遍适用于各种材料的超低温保存技术体系，也就是说一种材料一种方法，换种材料就需要重新探索一种新的处理方法。虽然物种进行规模化超低温保存的数量仍较少，但是植物种质资源的超低温保存技术具有广阔的发展前景，尤其在材料脱毒、抗性育种和遗传转化方面将具有更大的应用价值。 参考文献： [1]奉斌，魏忠芬，伍林涛，等.向日葵种质资源研究现状及类型[J].北京农业，2015（17）：12. 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