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新型免疫分子TRIM39及其缺失体参与抗禽白血病病毒作用

范文

刘妮妮张靓伍冰倩周泽建赵珩

摘要：禽白血病病毒（avian leukemia virus，简称ALV）引发的禽白血病致死率高达10%～20%，严重阻碍养殖业发展。通过构建TRIM39（tripartite motif 39）重组原核表达载体，分析其在抗禽白血病病毒中的作用，利用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测鸡白血病病毒抗原，获得细胞内外病毒浓度变化，发现TRIM39、TRIM39ΔRING（RING结构域缺失体）、TRIM39ΔB30.2（B-box结构域缺失体）对禽白血病病毒均有一定的抑制作用，并且缺失体的抑制效果明显更弱。研究结果提示，TRIM39参与抗禽白血病病毒的作用，且RING结构域和B-box结构域起着重要的作用。

关键词：TRIM39;TRIM39缺失体;新型免疫分子;禽白血病病毒

中图分类号： S852.65+7 ?文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）16-0063-04

收稿日期：2018-04-21

基金项目：中央民族大学一流学科建设项目（编号：YDZXXK201618）。

作者简介：刘妮妮（1992—），女，湖北汉川人，硕士，主要从事免疫学研究。

通信作者：赵珩，博士，教授，主要从事免疫学研究。

三重基序（TRIM）蛋白几乎存在于所有多细胞动物中，是一个古老且数量庞大的蛋白家族[1]。随着脊椎动物的进化，TRIM蛋白种类显著增加，迄今为止仅在人类基因组中就已发现近70种[2]。TRIM蛋白家族成员都拥有保守的RBCC结构，从N端至C端依次为RING结构域、1或2个B-box结构域及1个卷曲螺旋结构域（coil-coiled domin，简称CCD）[3]。这些结构域都具备各自的功能，RING结构域是由10～20个氨基酸组成的锌结合序列，研究发现，有些TRIM蛋白能够依赖RING结构域发挥E3连接酶活性，如TRIM21[4]、TRIM25[5]、TRIM11[6]等;B-box结构域同样是锌结合序列，目前对其功能研究还不够清楚，但其被证实对人类免疫缺陷病毒（HIV）具有抗性，能够影响TRIM5α对病毒的识别[7]以及TRIM15限制病毒复制的能力[8];卷曲螺旋结构域几乎总是跟随着B-box结构域，它主要会影响TRIM蛋白与其他蛋白相互作用的能力[9]。另外，TRIM蛋白C端结构域具有多样性且在不同蛋白之间的差异较大，通常由1个或多个类型不固定的结构域组成，根据C端结构域的不同，TRIM蛋白还被分为11类亚家族[10]。TRIM蛋白家族具有非常广泛的功能，参与了一系列重要的生命活动，例如转录调控、先天性免疫调控、细胞增殖与分化、细胞自噬与细胞凋亡、细胞周期调控等[11]，在生物机体中发挥着越来越重要的作用。

大量研究证实，TRIM蛋白家族成员具有抗病毒活性，它们不仅能够直接作用于病毒蛋白进而限制病毒的复制，还能参与调节免疫信号通路，诱导细胞因子的产生[12]。Stremlau等在非洲绿猴和猕猴中首次发现TRIM5α能够限制Ⅰ型艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，简称HIV-1）的侵染[13];Hattlmann等报道TRIM21能够与脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，简称EMCV）蛋白酶3C、流感病毒（influenza virus，简称IV）核蛋白（NP）相互作用，诱导蛋白发生泛素化降解以抑制病毒的复制[14];Bonilla等发现，脑膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，简称LCMV）致死TRIM19/PML缺失的小鼠的概率更高，说明TRIM19也具有抵病毒作用[15];另外，TRIM5/6/11/14/25/26/31/41可以限制乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，简称HBV）启动子增强剂的转录活性[16]。还有一些研究证明，TRIM蛋白能够使靶蛋白发生泛素化降解或蛋白酶体降解[17-19]，从而负调控免疫信号通路，如NF-κB、TLRs、RIG-Ⅰ等[20-21]。鸡马立克氏病与?MHC-B亚区有关，通过对MHC-B亚区进行分析发现了许多TRIM基因，而且这些基因表现出极高的单核苷酸多态性（SNP），说明TRIM基因可能具有抗马立克氏病的作用，但现在还没有足够的证据[22]。

禽白血病病毒（avian leukemia virus，简称ALV）属于反转录病毒科（Retroviridae），禽C型反转录病毒属，病毒粒子的直径为80～100 nm，由外部的囊膜和内部电子致密的核心构成[23]，是鸡群中普遍存在并常诱发肿瘤的病毒之一，其引发的禽白血病被我国政府列为二类动物疫病。根据病毒宿主范围、囊膜特性以及交叉中和反应的不同，可将ALV分为A～J 10个亚群[24]，其中A、B、C、D、E、J 6个亚群能够感染鸡群，在我国A、B、J亚群的感染現象较为普遍，它们可诱发鸡群淋巴细胞瘤、纤维肉瘤、髓细胞瘤、成红细胞瘤、骨硬化、血管瘤等不同类型的肿瘤[25]，还具有破坏免疫器官、组织和细胞的能力，使机体的免疫应答功能暂时性或永久性丧失，导致鸡的死亡率显著提高;另外，ALV的感染还会使鸡群的生长速度变缓，体质量增加变慢，产蛋率和蛋品质下降，而且由于禽白血病病毒具有横向及纵向传播特点[26-27]，加上家禽养殖高度集约化，使该病毒引发的禽白血病很难控制，目前尚未找到有效的防控方法，这对我国养殖业造成了巨大的经济损失。本研究以鸡TRIM39为研究对象，构建TRIM39及其缺失体的真核表达载体，以研究TRIM39抗禽白血病病毒的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物及病毒

鸡脾组织（英国剑桥大学Kaufma教授提供）;禽白血病病毒（ALV）（中国农业科学院生物技术研究所张志芳研究员提供）。试验时间为2016年8月至2018年3月;试验地点为中央民族大学生命与环境科学学院。

1.1.2 表达载体及菌株

pDsRed2-C1真核表达载体为笔者所在实验室保存;载体、大肠杆菌（Escherichia coli）Top10感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

1.1.3 酶和试剂

Trizol、Oligo-dT18、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、RNase抑制剂、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、96孔酶标板、胎牛血清素、胰酶细胞消化液、D-Hanks平衡盐溶液、禽白血病病毒检测试剂盒，均购自天根生化科技（北京）有限公司。EasyTaq DNA聚合酶、DNA Marker、Pfu DNA聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA连接酶，均购自NEB公司。PCR仪（Bio-Rad公司）、台式高速冷冻离心机（Eppendorf公司）、冷冻高速离心机（美国贝克曼公司）、倒置显微镜（日本Olympus公司）、酶标仪（美国Thermo公司）、生化培养箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据GenBank中鸡TRIM39基因序列号（NM_001006196.3），TRIM39结构域的生物信息学分析，利用DNAMAN对TRIM39进行比对，确定TRIM39缺RING结构域设计位置。利用Primer 5.0软件，依据pEGFP-N1真核表达载体及目的基因的结构特点，在引物上游加入Sal Ⅰ酶切位点，下游加入BamH Ⅰ酶切位点。TRIM39完整序列引物为P39F：5′-ACGCGTCGACATGGATGAAGATAACCCAG-3′和P39R：5′-CGGGATCCTCA-CGGGGACAGCGTGAAGCG-3′;TRIM39ΔRING序列引物为P39ΔRINGF：5′-ACGCGTCGACATGGATGAAGATAACCCAG-3′和P39ΔRINGR：5′-CGGGATTCTCACGGGGACAGCGTGAAGCG-3′，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 目的基因的获得

利用改良Trizol法提取鸡脾脏中的总RNA。逆转录获得cDNA后，分别以P39F2/P39R2、P39ΔRINGF/P39ΔRINGR、P39ΔB30.2F/P39ΔB30.2R为引物进行TRIM39完整序列、TRIM39ΔRING序列扩增，PCR反应体系为50 μL，包括10×buffer（缓冲液）5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）1.5 μL、Pfu DNA聚合酶（2 U/μL）1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 36.5 μL。反应体系：94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸3 min，共34个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。胶回收TRIM39基因片段，与pEASY-Blunt Simple载体连接，转化大肠杆菌（Escherichia coli） Top10感受态细胞，挑取单克隆进行菌落PCR检测，筛选阳性克隆送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

1.2.3 重组表达载体的构建与鉴定

以Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切含有TRIM39的pEASY-Blunt Simple载体和 pEGFP-N1真核表达载体，分离胶纯化回收目的片段。连接2个目的片段，转化E.coli Top10感受态细胞，挑取单克隆进行菌落PCR检测，筛选阳性克隆，提取质粒并用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ进行双酶切验证。TRIM39完整序列、TRIM39ΔRING序列以及与pDsRed2-C1真核表达载体的连接以及鉴定的具体操作方法同上。

1.2.4 鸡白血病病毒抗原（ALV-AG）酶联免疫吸附分析（ELISA）

用无菌管吸取细胞培养液，3 000 r/min离心2 min，收集上清用以检测细胞外病毒;用D-Hanks平衡盐溶液洗掉残余的细胞培养液，用胰酶消化液将细胞悬浮起来，收集于离心管中，12 000 r/min离心2 min使细胞沉淀，弃去胰酶消化液，加入磷酸缓冲盐溶液（PBS）重悬细胞，通过反复冻融使细胞破裂释放出细胞内成分，3 000 r/min离心2 min，收集上清用以检测细胞内病毒。采用禽白血病病毒检测试剂盒，ELISA法测定ALV-AG，检测细胞内外病毒浓度，具体步骤严格按照惠特比科技发展（北京）有限公司提供的说明书进行。

2 结果与分析

2.1 TRIM39、TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2片段的克隆

PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，由图1可知，获得的TRIM39完整序列长度约为1 410 bp，TRIM39ΔRING序列长度约为1 241 bp，TRIM39ΔB30.2序列长度约为894 bp，與预期基因大小相符。筛选阳性克隆送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序，测序结果正确，表明pEASY-Blunt Simple-TRIM39克隆载体构建成功。

2.2 重组表达载体pDsRed2-C1-TRIM39、pDsRed2-C1-TRIM39ΔRING、pDsRed2-C1-TRIM39ΔB30.2的鉴定

使用菌落PCR法鉴定阳性重组子，由图2可知，菌落PCR获得条带大小与PCR扩增获得的条带大小一致，说明TRIM39及其突变体已经构建到pDsRed2-C1真核表达载体上并成功转化大肠杆菌。

由图3可知，TRIM39完整序列、TRIM39缺RING突变体、TRIM39缺B30.2突变体构建到pDsRed2-C1的菌落PCR鉴定结果，与预期一致。图3的左图中TRIM39缺RING突变体条带明显比TRIM39缺RING突变体小，说明TRIM39缺RING突变体构建成功;图3的右图中2号和7号条带序列较TRIM39完整序列小，说明突变体构建成功。

2.3 禽病毒蛋白（ALV）滴度測定

细胞攻毒后7 d进行禽白血病病毒滴度测定，以标准物的浓度为纵坐标、以3次平行测定的D540 nm均值为横坐标作图，所得标准曲线中R2达到0.988 5（补充材料），禽病毒蛋白浓度曲线拟合曲线符合相关性检验（0

由图4-A可知，pDsRed2-C1-TRIM39完整序列转鸡胚成纤维细胞胞外禽白血病病毒浓度高于对照组但相差不大;pDsRed2-C1-TRIM39缺RING突变体转鸡胚成纤维细胞禽白血病病毒浓度与pDsRed2-C1-TRIM39缺B30.2突变体转鸡胚成纤维细胞相差不明显且高于pDsRed2-C1-TRIM39完整序列转鸡胚成纤维细胞;鸡胚成纤维细胞直接攻禽白血病病毒浓度较高，说明TRIM39具有一定的降低禽白血病病毒胞外分泌的作用。图4-B可知，pDsRed2-C1-TRIM39完整序列转鸡胚成纤维细胞胞内禽白血病病毒浓度明显高于对照组;pDsRed2-C1-TRIM39缺RING突变体转鸡胚成纤维细胞禽白血病病毒浓度与pDsRed2-C1-TRIM39缺B30.2突变体转鸡胚成纤维细胞相差不明显且明显高于 pDsRed2-C1-TRIM39完整序列转鸡胚成纤维细胞;鸡胚成纤维细胞直接攻禽白血病病毒浓度较pDsRed2-C1-TRIM39完整序列转鸡胚成纤维细胞高，且低于pDsRed2-C1-TRIM39缺B30.2突变体转鸡胚成纤维细胞，说明TRIM39具有一定的降低胞内禽白血病病毒的作用。

3 讨论

本研究通过基因重组技术获得了鸡TRIM39基因的原核表达载体，为避免基因反向插入的问题，在设计引物时有意识地引入了BamH Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切位点，保证了目的片段正确插入原核表达载体并与载体拥有一致的开放阅读框。研究选用E. coli Rosetta作为表达菌株，它是一个广泛用于表达外源蛋白的菌株，外源基因的诱导表达受温度、诱导时间等的影响。首先，诱导温度的高低会影响表达蛋白的溶解性，37 ℃诱导的上清液中可溶性蛋白含量明显少于28 ℃诱导的，说明低温条件有利于TRIM39的可溶性表达，因此本试验中采用 28 ℃ 诱导重组蛋白的表达，以获得具有活性的可溶性蛋白用于纯化，但是诱导时间长短对蛋白表达量影响并不大。

另外，本研究中采用生物信息学分析手段设计引物并成功获得了TRIM39基因的2个突变体，即TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2。根据报道，TRIM蛋白家族对逆转录病毒具有一定的抑制作用，因此本研究以禽白血病病毒为模型，研究了TRIM39、TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2蛋白对禽白血病病毒的抑制作用，发现三者均有抗病毒效应，但是TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2蛋白的抑制效果明显弱于TRIM39蛋白，说明RING结构域及B-box结构域可能对TRIM39的抗病毒效应有一定的影响。另外，本试验结果还表明，TRIM39、TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2蛋白还可能影响禽白血病病毒的细胞外释放，而且TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2处理组细胞的病毒胞外释放量高于TRIM39处理组，说明TRIM39的抑制作用可能通过抑制病毒的释放实现，但RING结构域及B-box结构域在此过程中是否发挥作用还需进一步验证。

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