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紫茎泽兰处理鸡球虫卵囊的免疫效果评价

范文

晏云涛吕瑞青项勋李朝杨建发段纲

摘要：为了评价紫茎泽兰对鸡柔嫩艾美尔球虫卵囊活性的抑制效果，采用不同浓度紫茎泽兰提取液处理新鲜的鸡球虫卵囊，计算各组的孢子化率，并将处理后的孢子化卵囊接种幼鸡，再进行攻毒保护试验，通过测克卵囊数（指1 g粪便中含有的卵囊数）、抗球虫指数等指标，综合评价紫茎泽兰对鸡球虫卵囊活性的影响。结果显示，紫茎泽兰处理组的球虫孢子化率受到不同程度的抑制，与对照组存在显著差异（P<0.05），对处理组幼鸡进行免疫攻毒，其存活率（100%）、抗球虫指数（186.6）、增质量率（99.6%）和病变记分（+0.7）均优于阳性对照组，且免疫组与阳性对照组抗球虫指数之间差异极显著（P<0.01），表明紫茎泽兰可致弱鸡球虫卵囊活性，为紫茎泽兰研制成病原致弱剂或杀虫剂奠定了基础，也为球虫致弱和球虫基因缺失苗的研究提供了新思路。

关键词：鸡球虫;紫茎泽兰;孢子化率;抗球虫指数

中图分类号： S858.31 ?文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2019）16-0171-03

收稿日期：2018-05-09

基金项目：国家重点研发计划专项（编号：2017YFD0501405、2017YFD0501303）。

作者简介：晏云涛（1994—），女，云南昆明人，硕士研究生，主要从事畜禽寄生虫病研究，

通信作者：段纲，硕士，教授，主要从事畜禽药理毒理学研究。

紫茎泽兰（Euptorium adenophorum Spreng）是一种外来入侵植物，具有极强的适应性和侵占能力，会破坏生态的多样性[1]。紫茎泽兰危害性极强，可以引起人皮肤红肿，甚至出现接触性皮炎，牲畜容易误食紫茎泽兰，从而引起腹泻、脱毛、流产甚至死亡[2]，牛、马等动物吸入紫茎泽兰带有纤毛的种子和花粉后容易引起哮喘，用紫茎泽兰垫羊圈，可引起羊蹄腐烂[3]。在国家生态环境部公布的首批入侵国内的16种外来物种黑名单中，紫茎泽兰名列第一，被称为“生物癌症”[4]。因此，许多科研工作者将目光投向紫莖泽兰的生态利用，周世敏等研究表明，以紫茎泽兰为原料制成的生物碳的燃烧值（4.42×107 J/kg）明显大于以德国橡木为原材料生产的生物碳的燃烧值（3.4×107 J/kg）[5];田果廷等用紫茎泽兰作栽培原料可栽培出田头菇、平菇、金针菇、柳松茸、香菇和鸡腿菇等多种食用菌，其产量高、成本低、营养丰富、食用安全[6];王凤等以紫茎泽兰草粉为载体制成的芳香防蛀缓释片剂外形完好且香味持久，可达3个月以上[7]。

鸡感染球虫病（coccidiosis）主要通过摄入有活力的孢子化卵囊，凡被带虫鸡的粪便污染了的饲料、饮水、用具和土壤等，都可能传播球虫[8-9]，导致家畜饲养环境的污染。目前，鸡球虫病的防治多采用化学药物，其产生的耐药性、肉蛋产品药物残留、环境污染等问题也日趋严重[10]。

本试验选用紫茎泽兰作用于鸡球虫卵囊，通过攻毒保护试验，观测处理后的卵囊对鸡的免疫保护效果，为将紫茎泽兰开发为兽医临床实践的植物抑制剂、消毒剂，替代其他化学消毒药品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 球虫虫株

本试验所用鸡球虫卵囊为云南农业大学寄生虫实验室保存的鸡柔嫩艾美耳球虫，于2017年11月通过感染小鸡获得新鲜卵囊。

1.1.2 试验动物

7日龄白羽肉鸡，2017年11月购自云南省昆明市某市场，在严格消毒的无球虫环境下饲养，器具使用前严格消毒，所用饲料为自行配制，不含驱虫药物。试验前镜检粪便，确定无球虫感染。

1.1.3 主要试剂

紫茎泽兰初提液;0.5%重铬酸钾;3% NaOH;饱和食盐水;95%乙醇。

1.2 试验方法

1.2.1 紫茎泽兰初提液的制备

称取500 g紫茎泽兰粉末，加10倍量的95%乙醇，于50 ℃加热浸提4 h;依次使用60目、200目网筛将浸提液过滤到灭菌广口瓶中，用布氏漏斗过滤，滤渣用95%乙醇再次浸提4 h，过滤，如此重复过滤3次，再将每次过滤后的滤液混合;滤液经60 ℃水浴旋转蒸发仪减压蒸馏至黑褐色膏状物且质量不再变化为止;将得到的膏状浓缩物用电子天平准确称质量，然后用灭菌水将膏状浓缩物配成 1 g/mL 的母液，配好的母液密封、避光，于4 ℃保存备用[11]。

1.2.2 新鲜鸡球虫卵囊的准备

用笔者所在实验室保存的鸡柔嫩艾美尔球虫卵囊接种15日龄鸡，接种量为 7 000个/羽，严格消毒，分笼饲养，感染后7 d进行粪检，连续收集 7～9 d 的粪便，收集未孢子化的卵囊。

1.2.3 试验分组设计

在培养皿内分别加入10 mL 0.5%重铬酸钾溶液和104个分离的球虫卵囊，1～5号加入一定量的紫茎泽兰液，调整其终浓度为0.1%、0.5%、1.0%、2.5%和5.0%，每个浓度组做3个平行试验;6号加入0.5 mL蒸馏水作为阴性对照;7号加入0.5 mL 3% NaOH作为阳性对照。将各培养皿放入29 ℃温箱中进行孢子化培养，每天用胶头吸管间断性吹气3次，36 h后显微镜下计数具有感染性卵囊的孢子化率[12]。

1.2.4 紫茎泽兰处理后的孢子化卵囊感染动物试验

将上述试验中5个不同浓度处理后试验组、阴性和阳性对照组的孢子化卵囊分别接种15日龄幼鸡，接种剂量按照2 000个/羽，每组接种20羽幼鸡，同时设接种0.5 mL蒸馏水作为空白对照，接种前称取每组鸡的体质量。攻毒后6 d进行卵囊计数，10 d后记录鸡死亡和增质量情况，剖杀所有鸡，进行病变记分、计算抗球虫指数（ACI）。

1.2.5 攻毒保护试验

用紫莖泽兰液处理的最佳浓度组孢子化卵囊接种（首次免疫）20羽15日龄的小鸡，免疫接种剂量为2 000个/羽，接种后15 d，试验组小鸡再用强毒球虫攻毒，攻毒剂量为105个孢子化球虫卵囊/羽，攻毒后6 d进行卵囊计数，10 d后记录鸡死亡和增质量情况，剖杀全部鸡进行病变记分、计算ACI;同时设立阳性对照组（不免疫攻毒组）、阴性对照组（不免疫不攻毒空白组）。通过上述指标综合评价紫茎泽兰液致弱球虫的免疫保护力。

1.2.6 评价指标

克卵囊数（OPG）、病变记分、血粪值和ACI的计算参照文献[13]。

2 结果与分析

2.1 紫茎泽兰对鸡球虫孢子化的影响

球虫卵囊孵化3 d后，收集各组球虫卵囊，并计算各组孢子化率，每组计算3次，求平均值。结果发现，与对照组相比，各紫茎泽兰处理组的球虫孢子化受到了不同程度的抑制（表1），且通过SPSS 22.0数据分析软件进行方差分析显示，试验组与对照组间孢子化存在显著差异（P=0.029<0.05）。

2.2 紫茎泽兰处理后孢子化卵囊感染动物的结果

攻毒后6 d，收集各组鸡粪便，用改良麦克马斯特计数板计算粪便中的OPG，结果发现，各试验组单位质量粪便卵囊数均小于阳性对照组，且随着紫茎泽兰液浓度的增加，单位质量卵囊数有逐渐减小的趋势。攻毒后10 d，统计各组鸡的存活率、相对增质量率，剖杀鸡，进行病变记分，统计血粪值、ACI，见表2。结果显示，与对照组相比，各试验组和阴性对照组的鸡未有死亡;阴性对照组鸡肠道无病变发生，各试验组鸡肠道病变程度较阳性对照组轻，详见图1至图7。说明紫茎泽兰液对鸡具有一定的免疫保护性。各试验组的相对增质量率和抗球虫指数均高于阳性对照组，各相对增质量率和抗球虫指数随着紫茎泽兰液终浓度的增加也呈提高的趋势，且50%和2.5%浓度组表现出了中等抗球虫效果。SPSS 22.0数据分析显示，试验组与阳性对照组间抗球虫指数存在显著差异（P=0.018<0.05）。

2.3 紫茎泽兰处理后孢子化卵囊的免疫保护结果

在免疫攻毒后6 d，收集紫茎泽兰5%浓度试验组与对照组鸡粪便，用改良麦克马斯特计数板计算OPG，结果发现，试验组的克卵囊数显著少于阳性对照组，阴性对照无球虫卵囊检出，详见表3。免疫攻毒后10 d，统计各组鸡存活率、相对增质量率，剖杀鸡，进行病变记分，统计血粪值，计算ACI，发现试验组鸡未有死亡，肠道病变较轻微，只有少量出血，见图8至图10。相对增质量率和抗球虫指数都显著高于阳性对照组，且抗球虫指数>180，属于高效抗球虫，经SPSS 22.0数据分析显示，免疫组与阳性对照组抗球虫指数之间差异极显著（P=0<0.01）。由此可见，经紫茎泽兰处理的球虫卵囊对鸡有良好的免疫保护性。

3 讨论

已有报道表明，紫茎泽兰具有抑制动物寄生虫虫体或虫卵活性的效果。在26 ℃条件下，紫茎泽兰花叶提取液作用于马圆线虫虫卵，隔天取样5 g用漂浮法记录虫卵孵化情况，表明高浓度浸泡液中虫卵的检出率较低，孵出的幼虫不能正常发育[14];不同分子质量的紫茎泽兰液作用于未孢子化的孔雀球虫卵囊会抑制其卵囊活性[15];椎实螺放入紫茎泽兰不同浓度不同部位的浸泡液中，根茎花叶都具有杀灭螺的效果，仅作用时间长短不同[16];紫茎泽兰95%乙醇提取物对兔痒螨和疥螨具有较强的离体杀灭活性;紫茎泽兰石油醚萃取物对牛足螨也有较强的离体杀灭活性[17];紫茎泽兰经甲醇石油醚丙酮萃取后对黏虫触杀效果较好的部位是花和叶[18]。

云南省多样的气候环境，导致云南省很多养鸡场时有球虫病发生，据报道，云南省多数养鸡场球虫病的防治成本占全部防治疾病成本的30%[19]。在临床上，抗球虫药分为聚醚类离子载体抗生素和化学合成药，?其对球虫的防控和治疗发挥了重要的作用，但由于药物滥用，导致耐药虫株产生、药物残留、污染环境等问题;部分鸡场联合使用多价球虫疫苗，而疫苗使用不当导致鸡发病的情况时有发生，多价疫苗的使用也有可能给当地带来以前没有的球虫新种。为此，开发新型植物抗球虫药就显得尤为迫切。袁铭雅用紫茎泽兰治疗鸡球虫病，能干扰虫卵的正常孵化过程，抑制卵囊的生长繁殖[20];谭文彪等用紫茎泽兰花的第三级提取物治疗鸡球虫病，其抗球虫指数为180.20，疗效达到高效[21];和晓银用紫茎泽兰的异丙醇提取物2级分离物对鸡球虫病的治疗效果ACI为174，属于中效偏上[22]。

结果表明，各试验组ACI随紫茎泽兰液浓度的增加而增大，各试验组OPG随紫茎泽兰液浓度的增加有逐渐减小的趋势，提示紫茎泽兰提取物能有效抑制鸡球虫卵囊的活性。

4 结论

本试验用紫茎泽兰提取液处理后的球虫孢子化率显著低于对照组，紫茎泽兰作用的试验组抗球虫指数显著高于阳性对照组，且抗球虫指数>180，属于高效抗球虫，说明紫茎泽兰抑制了鸡球虫孢子化阶段的活性。

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