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花生3-磷酸甘油酰基转移酶基因的功能鉴定

范文

姜竹陈丹丹刘宏波

摘要：花生（Arachis hypogaea）是我国的主要油料作物，花生油脂的合成受3-磷酸甘油酰基转移酶（GPAT）调控，但其调控机制尚不清楚。从花生中克隆了13个GPAT基因，编码含有4个酰基转移酶保守结构域的蛋白;同时，运用酵母遗传互补体系对基因功能进行了鉴定。在该体系中，酵母双突变体菌株ZAFU1（Δgat1/Δgat2）因缺少GPAT而不能在特定的葡萄糖培养基上生长。结果表明，AhGPAT1/2/3/6/9与空白载体一样，其导入并不能恢复酵母双突变体ZAFU1在葡萄糖中的生长缺陷，而AhGPAT5B、AhGPAT7A/B的导入能恢复酵母双突变体ZAFU1在葡萄糖中的生长缺陷，说明上述3个基因具有酰基转移酶活性，从而为进一步研究花生油脂的合成代谢调控提供了参考。

关键词：花生;3-磷酸甘油酰基转移酶（GPAT）;遗传互补;酵母双突变体菌株

中图分类号： S565.201 ?文献标志码： A ?文章编号：1002-1302（2019）22-0056-05

油脂是高等植物的主要能量储存形式，可为植物的种子萌发、花粉发育和有性生殖等提供能量，对于植物的生长发育至关重要[1]。植物油可为人类提供能量和营养，同时也是重要的工业原料[2]。我国的花生（Arachis hypogaea）总产量、单位面积产量和出口量一直位居我国油料作物之首，在我国油脂供应、出口创税和国民经济发展中占有举足轻重的地位，但是花生油脂的合成机制目前尚不清楚[3-4]。

植物油的主要成分是三酰甘油（TAG），由3-磷酸甘油酰基转移酶（GPAT）、溶血磷脂酸酰基转移酶（LPAAT）和二酰甘油酰基转移酶（DGAT）依次催化脂肪酸链掺入甘油骨架的sn-1、sn-2、sn-3位而生成[5-6]。目前，关于甘油脂合成前2步酰化反应的酶，特别是第1步酰化反应的酶知之甚少。研究者在拟南芥、油菜、水稻和向日葵等多种植物中已成功克隆了多个编码酰基转移酶的GPAT基因[7]，但普遍认为，除了ATS1，只有GPAT9直接参与甘油脂的合成，其他GPAT是否参与甘油脂合成并不清楚[8-10]。已有研究者从花生中克隆了部分GPAT基因，并对其表达特性进行了分析，但是关于花生GPAT酶的特性尚无相关报道[11-12]。本研究从山花15中分离了13个3-磷酸甘油酰基转移酶基因，并用酵母遗传互补体系对上述基因进行了功能鉴定，发现AhGPAT1/2/3/6/9不能恢复酵母双突变体ZAFU1在葡萄糖中的生长，AhGPAT5B、AhGPAT7A/B能恢复酵母双突变体ZAFU1在葡萄糖中的生长，说明上述3个基因具有酰基转移酶活性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

花生品种山花15、酵母菌株ZAFU1[13]、大肠杆菌菌株DH5α和酵母表达载体pYES2-yADH1-Kan V2[14]均由笔者所在实验室保存。RNA提取试剂盒，购自杭州新景生物试剂开发有限公司;质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒，购自生工生物工程（上海）股份有限公司;高保真酶PrimeSTAR、PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒、DNA连接酶以及限制性内切酶，购自TaKaRa公司。引物由赛默飞世尔科技有限公司合成。基因测序由铂尚生物技术有限公司完成。

1.2 RNA的提取及cDNA的合成

参照植物总RNA提取试剂盒说明书提取花生根、叶的总RNA。测定总RNA的浓度和纯度，用琼脂糖凝胶电泳检测验证RNA的完整性，用反转录试剂盒反转录合成cDNA。

1.3 基因克隆和重组载体的构建

参考已有的研究，检索得到花生GPAT1/2/3/5/6/8/9基因的核苷酸序列，以这些基因结合拟南芥GPAT氨基酸序列，在花生数据库peanutbase中进行同源检索，得到候选AhGPAT序列，基于此确定花生GPAT1A/1B/2A/2B/3B/5B/6A/7A/7B/8A/9A-1/9A-2/9B序列的信息。结合候选基因序列和表达载体酶切位点，在SIGMA网站上设计各基因的PCR扩增引物（表1）。

以花生cDNA为模板，用带有酶切位点的引物进行RT-PCR扩增，并对目的片段进行胶回收。将酶切后的AhGPAT与酵母表达载体pYES2-yADH1-Kan V2进行连接，转化至大肠杆菌DH5α中，涂布在含有50 mg/L卡那霉素的LB培养基上，37 ℃过夜培养，次日进行菌落PCR检测，并进行测序和序列比对。最后提取测序成功的AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2重组质粒备用。

1.4 系统发育树分析

使用DNAMAN对已克隆的10个AhGPAT基因（AhGPAT1A/1B/2A/2B/3B/5B/6A/7A/7B/8A）编码的蛋白氨基酸序列进行比对，使用MEGAX软件对AhGPAT的氨基酸序列进行系统发育树分析，系统发育树采用Neighbour-Joining（邻接）方法[15-16]构建。

1.5 AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2载体转化酵母双突变体及酵母浓度梯度稀释试验

通过LiAc法制备ZAFU1酵母感受态细胞，将重组质粒AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2、pYES2-yADH1-Kan V2空白载体和GAT1-pYES2-yADH1-Kan V2陽性对照转入酵母双突变体ZAFU1感受态中。分别涂布于含有葡萄糖（glucose）、半乳糖（galactose）的SC-Ura-His-Leu固体培养基上，于30 ℃培养4～7 d。挑选SC-Ura-His-Leu+葡萄糖固体培养基中的酵母单菌落进行摇菌培养，将菌液分别稀释至D600 nm=1、0.2，0.04、0.008、0.000 16，取5 μL分别涂布于SC-Ura-His-Leu+半乳糖、SC-Ura-His-Leu+葡萄糖固体培养基上，于30 ℃培养4～7 d。

2 结果与分析

2.1 不同AhGPAT氨基酸序列的差异分析

本研究分离了AhGPAT的8个不同成员，共13个基因。分离的由AhGPAT编码的蛋白羧基端均有典型的酰基转移酶的4个保守结构域（AhGPAT9除外）：AT-Ⅰ、AT-Ⅱ、AT-Ⅲ 和AT-Ⅳ（图1），保守结构域中与酰基转移酶催化活性相关的氨基酸是AT-Ⅰ 的组氨酸（His）及天冬氨酸（Asp）、AT-Ⅲ 的甘氨酸（Gly）、AT-IV的脯氨酸（Pro）;与底物甘油绑定相关的氨基酸是AT-Ⅱ的精氨酸（Arg）、AT-Ⅲ 的谷氨酸（Glu）。

为了更好地确定花生GPAT的亲缘关系，对AhGPAT进行系统发育树分析，并对部分AhGPAT进行氨基酸序列比对。

结果显示，分离的由AhGPAT编码的蛋白之间的氨基酸序列相似度为19.1%～99.7%。栽培花生A/B 2个亚基因组和亚基因组内由AhGPAT编码的蛋白氨基酸相似度极高，为 96.3%～99.7%。系统发育树结果表明，分离的由AhGPAT编码的蛋白可聚成两大分支：AhGPAT1/2/3/5/6/7/8和AhGPAT9（图2）。其中，AhGPAT1/2/3/5/6/7/8蛋白可分为3个亚家族：AhGPAT1/2/3、AhGPAT5/7和AhGPAT6/8;AhGPAT2和AhGPAT3的亲缘关系较近，AhGPAT3B氨基酸序列与AhGPAT2A、AhGPAT2B氨基酸序列的相似度分别为73.0%、73.2%。AhGPAT5/7的亲缘关系较近，AhGPAT5B氨基酸序列与AhGPAT7A、AhGPAT7B氨基酸序列的相似度分别为80.4%、80.9%。AhGPAT6A与AhGPAT8A的亲缘关系较近，二者的氨基酸序列相似度为74.9%。AhGPAT9与其他AhGPAT的亲缘关系较远。

2.2 AhGPAT的功能分析

2.2.1 重组酵母表达载体的构建对AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2重组质粒进行酶切鉴定，获得如图3所示与预期大小一致的目的条带，表明AhGPAT-pYES2-yADH1-KanV2重组质粒已构建成功。

2.2.2 酵母遗传互补及酵母浓度梯度稀释试验笔者所在实验室构建了GAT1、GAT2双敲除的ZAFU1（gat1Δgat2Δ+[pGAL1：：At1g06520 Leu2]）菌株，其本身含有His3筛选标记，同时含有Leu2筛选标记的YEplac181-AtGPAT1重组质粒，该质粒GAL1启动子在半乳糖条件下能够诱导AtGPAT1基因的表达，但在葡萄糖条件下，AtGPAT1基因不能表达。因此该酵母双突变体ZAFU1只能在SC+Ura-His-Leu+Galactose培养基中生长，不能在SC+Ura-His-Leu+Glucose培养基中生长。pYES2-yADH1-Kan V2空白载体含有合成尿嘧啶的基因，该质粒yADH1启动子受葡萄糖诱导，受半乳糖抑制，因此转入该载体的酵母菌株若能在 SC-Ura-His-Leu+Glucose 培养基上生长，则证明转入酵母双突变体ZAFU1的目的基因具有酰基转移酶活性。

本研究将转化重组质粒AhGPAT-pYES2-yADH1-Kan V2、pYES2-yADH1-Kan V2空白载体和GAT1-pYES2-yADH1-Kan V2的酵母双突变体分别培养在SC-Ura-His-Leu+Galactose、SC-Ura-His-Leu+Glucose培养基上，发现转pYES2-yADH1-Kan V2空白载体和AhGPAT1A/1B/2A/2B/3B/6A/9A-1/9A-2/9B的酵母双突变体均不能在SC-Ura-His-Leu+Glucose培养基上生长，而转GAT1阳性对照、AhGPAT5B、AhGPAT7A/B的酵母双突变体能在SC-Ura-His-Leu+Glucose培养基上生长，说明AhGPAT5B、AhGPAT7A/B具有酰基转移酶活性（图4）。将转AhGPAT5B、AhGPAT7A/B的酵母双突变体进行浓度梯度稀释培养后，发现它们均能很好地恢复酵母双突变体ZAFU1在葡萄糖培养基上的生长（图5）。转AhGPAT8A的ZAFU1酵母在SC-Ura-His-Leu+Glucose上有少数几个酵母菌落生长，其功能有待进一步探究。将AhGPAT转入条件致死型酵母双突变体ZAFU1中，从葡萄糖或半乳糖培养基上挑取单个菌落稀释（1 ∶ 5）后，分别涂布在SC-Ura-His-Leu+Glucose、SC-Ura-His-Leu+Galactose固体培养基上。

3 结论与讨论

本研究从花生中分离了13个3-磷酸甘油酰基转移酶基因，编码的蛋白均具有酰基转移酶的4个保守结构域[17]。运用酵母遗传互补体系对AhGPAT的酰基转移酶活性进行了鉴定，发现AhGPAT5B/7A/7B能恢复酵母双突变体ZAFU1在葡萄糖培养基中的生长，表明其具有酰基转移酶活性。

拟南芥AtGPAT1具有酰基转移酶活性，而花生AhGPAT1A、AhGPAT1B在酵母遗传互补体系中均不能恢复酵母双突变体ZAFU1的生长，AhGPAT1A/B与AtGPAT1的氨基酸相似度分别只有65.8%、66.1%，AhGPAT1A/B与AtGPAT1的氨基酸序列差异较大，目前尚不清楚这些序列差异是否影响了AhGPAT1A/B的酰基转移酶活性。

根据前人的研究及花生基因组数据库信息，AhGPAT5、AhGPAT7在根、花中的表达量较高，但是这些基因在种子中的表达量较低，而花生根和花的油脂含量低[11]。目前尚不清楚这些基因是否参与种子中油脂、膜脂合成，AhGPAT5、AhGPAT7的功能差異有待进一步探究。

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