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牡丹种皮乙酸乙酯提取物抗癌活性研究

范文

张芳娟牛颜冰申少斐

摘要：研究了牡丹种皮乙酸乙酯提取物对人源性乳腺癌细胞株（MCF-7）的增殖抑制率及细胞活性的影响。制备不同浓度梯度的牡丹种皮乙酸乙酯提物作用于MCF-7细胞，通过细胞形态学分析，AO/PI双染色，MTT法和线粒体膜电位法检测MCF-7细胞的生长活力，增殖抑制能力和线粒体膜电位变化。研究结果表明，当牡丹种皮乙酸乙酯提物质量浓度为5 mg/mL时，对MCF-7细胞的抑制效果最佳，细胞抑制率可达89.67%，并且在药物作用下，细胞活性和线粒体膜电位均明显下降。牡丹种皮乙酸乙酯提取物对乳腺癌细胞MCF-7的生长有抑制作用，能够降低细胞活性，促使MCF-7细胞线粒体膜电位降低，诱导细胞产生凋亡现象。

关键词：牡丹种皮;乙酸乙酯提取物;MCF-7细胞;细胞活性

中图分类号： R284.2; R285文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）04-0192-05

收稿日期：2018-12-09

基金项目：山西农业大学博士科研启动基金（编号：2016YJ02）;山西省重点研发计划重点项目（编号：201703D211001）;国家现代农业产业技术体系（编号：CARS-21）。

作者简介：张芳娟（1994—），女，甘肃天水人，硕士研究生，主要从事生物化学与分子生物学研究。E-mail：18306891750@163.com。

通信作者：申少斐，副教授，主要从事功能活性天然产物的研发和利用研究。E-mail：shenshaofei@nwafu.edu.cn。

癌症是剥夺人类生命的重要疾病之一，全球患癌人数在不断增加，癌症已经成为危害社会发展、人类生活以及健康的主要因素之一[1]。全球范围内，每年约有120万的女性被乳腺癌折磨，超过50%的人死亡[2]，每年增加的乳腺癌患者数量达20多万，其中青年得病率占同期患者的20%，并呈逐渐上升趋势[3-4]。在我国癌症排行榜中，肝癌、乳腺癌、肺癌居于前十。近年来，由于人们生活习性、饮食等方面的变化，我国乳腺癌的发生率增长近3%，对女性健康产生极大影响，相关部门已将其列为重点防治对象。为减弱其发病率和死亡率应适时做一些早期检查，同时加强女性对乳腺癌疾病的认识[5]。

牡丹（Paeonia suffruticosa）是我国的本土花卉。2011年国家卫生部正式将凤丹（P.ostii T.Hong et J.X.Zhang）和紫斑牡丹（P. rockii）的籽仁油作为新资源食品应用（中华人民共和国卫生部2011年第9号公告）[6]。牡丹籽油中含丰富的不饱和脂肪酸[7]，兼具保健和药用价值。牡丹种皮作为牡丹榨油后的副产物，鲜少有关于其的应用研究。刘普等于2014年对牡丹饼粕的化学成分进行分析，首次在该品种中分离得到10个低聚茋类化合物，并通过有机波谱分析明确了这些物质的组成[8];Gao等于2017年对牡丹种子研究分析其10种低聚茋化合物在癌细胞中的抗增殖和抗转移的作用，并且研究发现的茋类化合物（Sufffruticosol A、Sufffruticosol B、Sufffruticosol C）是牡丹种子所特有的[9]。

目前，关于牡丹种皮提取物对癌细胞作用效果的研究报道较少。本试验以牡丹种皮乙酸乙酯提取物为研究对象，设置不同的药物浓度梯度作用于乳腺癌MCF-7细胞，研究其对MCF-7细胞的细胞活性、增殖抑制作用等的影响，为牡丹种皮今后的药用价值提供一定的理论依据，同时增强牡丹种皮的附加价值，符合循环经济发展的新方向。

1?材料与方法

1.1?试验材料

牡丹种子为山西汾河牡丹实业股份有限公司提供油用牡丹凤丹种子;MCF-7人源性乳腺癌细胞株为中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供。

DMEM培养基，FBS胎牛血清，美国GIBCO实验室;胰蛋白酶，美国Sigma公司;双抗，北京全式金生物技术有限公司;吖啶橙（acridine orange，简称AO）、碘化丙啶（propidium iodide，简称PI）、Hoechst33342染液、JC-1 染色剂，江苏凯基生物技术股份有限公司;MTT、PBS缓冲液，北京索莱宝科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯等级。试验所涉及细胞培养相关的溶液均已无菌处理。

1.2?主要仪器

CO2恒温培养箱，美国Thermo公司;超净工作台，美国Thermo公司;移液枪，德国Eppenddorf公司;SZX16型显微镜，日本Olympus公司;CKX41型倒置荧光显微镜，日本Olympus公司;TC20自动细胞计数器，美国Thermo公司;KDC-40型离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司;超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技有限公司。

1.3?试验方法

1.3.1?牡丹种皮乙酸乙酯提取物的制备

称取适量牡丹籽粕粉末，加入60%乙醇，利用闪式提取器进行提取。将提取液离心处理后取上清，在温度为70 ℃ 条件下减压蒸发去除乙醇，将乙醇提取物与超纯水混合，超声完全溶解，获得水悬液，之后放置于分液漏斗中;加适量乙酸乙酯，振荡混匀，静置分层，上层为乙酸乙酯层，经一系列处理后冷冻干燥得到乙酸乙酯提取物（ZT），称质量。

1.3.2?细胞培养

采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，依照Song等的方法[10]在温度为37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，之后取对数生长期的细胞用于后续试验研究。

1.3.3?四甲基偶氮唑盐微量酶反应（MTT）法检测细胞致死率

MTT法能够对细胞活性进行检测[11]。MTT可使细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶还原成较难溶的蓝色结晶，之后通过二甲基亚砜（DMSO）将其溶解，在490 nm下测量吸光度（D）。本试验通过MTT法检测药物作用下MCF-7細胞的致死率。

（1）取处于对数生长期的MCF-7细胞，经胰蛋白酶消化处理后，DMEM培养基制成细胞悬液，接种于96孔板，每孔100 μL。（2）放入CO2恒温培养箱中孵育至细胞贴壁。（3）贴壁后弃去原有培养液，分别加入90 μL不同质量浓度（1、2、3、4、5 mg/mL）牡丹种皮乙酸乙酯提取物，3个重复，试验设置阴性对照组和阳性对照组，调零孔（仅含有DMEM培养基），放入培养箱培养。（4）药物处理24、36、48、72 h 后，各组每孔加入MTT溶液10 μL，90 μL新鲜培养基，置于培养箱中连续孵育4～6 h。（5）弃上清，每孔加入110 μL 甲臜（formazan）溶解液，摇床上低速振荡10 min，使结晶物完全溶解。（6）酶联免疫检测仪490 nm处进行每孔D值的收集，每组设定3个复孔。（7）计算相关的细胞抑制率。

细胞抑制率=（阴性对照组D值-试验组D值）/阴性对照组D值×100%。

1.3.4?细胞染色

AO能够透过正常细胞完整的细胞膜，在荧光显微镜下激发出的绿色荧光是AO与细胞中的DNA结合，而激发出的橘黄色或橘红色荧光则是其与细胞中的RNA结合[12]。PI则无法透过正常细胞的细胞膜进入细胞内，但是能够穿过凋亡或已经死亡细胞破损的细胞膜进入细胞内，在荧光显微镜下激发出的红色荧光是由于其嵌入到凋亡细胞双链DNA中[13]。本试验利用AO/PI双染法[14]和Hoechst 33342染色法在显微镜下观察在药物作用下MCF-7细胞的形态变化，分析正常细胞与凋亡细胞的分布情况。

1.3.5?线粒体膜电位检测

癌细胞内线粒体膜电位的高低能够表示细胞生长活性的强弱，正常的癌细胞中线粒体膜电位比较高，而细胞发生凋亡时早期的一个标志事件即线粒体膜电位降低。JC-1荧光染料[15]通常用来检测细胞线粒体膜电位，其以单体和多聚体的状态与细胞结合，在显微镜下可呈现出绿色或红色荧光。正常状态下的细胞线粒体膜电位较高，JC-1聚集在线粒体基质上，生成多聚体，表现出红色荧光;相反，当细胞线粒体膜电位降低时，JC-1则不能聚集，只能以单体形式存在，表现为绿色荧光[16]。

本试验通过染色剂JC-1对乙酸乙酯提取物作用后的MCF-7细胞进行染色，将细胞（细胞密度为1×106 CFU/mL）接种于48孔板，次日用0、1、3 mg/mL 乙酸乙酯提取物作用于细胞。48 h后冲去原有培养基，加入配制好的染液，于培养箱中避光放置20 min。用PBS洗涤2～3次，之后在显微镜下观察MCF-7细胞的线粒体膜电位变化情况。

2?结果与分析

2.1?MTT法结果

不同浓度乙酸乙酯提取物作用于MCF-7细胞72 h后细胞的形态变化情况见图1，发现对照组中的细胞生长良好，呈贴壁生长状态，杂质少，细胞轮廓较为清晰，细胞密度大;而上药组中细胞形态发生变化，形状变小，出现死亡或凋亡细胞以及细胞残渣和废弃物。说明乙酸乙酯提取物对MCF-7细胞有明显的抑制作用，并且其对细胞的抑制效果随着药物浓度的增大而增大。

表1显示，随着药物浓度和作用时间的增大，细胞抑制率呈上升趋势，当药物作用72 h后，ZT质量浓度为5 mg/mL时，药物对细胞的抑制效率最佳，细胞抑制率为89.67%，说明牡丹种皮乙酸乙酯提取物对MCF-7细胞有明显的抑制作用，并且抑制效果呈现出一定的时间依赖性和剂量依赖性。

从图2可以看出，乙酸乙酯提取物对MCF-7细胞有较强的抑制效果，药物质量浓度相同时，细胞生长抑制率随着药物作用时间的延长而增加;药物作用时间一定时，药物质量浓度越大，对细胞的抑制效果越佳。

2.2?Hoechst 33342染色

利用Hoechst 33342染液对MCF-7细胞进行活力检测，不同浓度乙酸乙酯提取物作用下MCF-7细胞的形态变化见图3，发现对照组中的细胞生长状态正常，活性良好，细胞与染液结合，被染成均匀的蓝色。而给药组中的细胞在药物作用下，形态产生变化，体积变小，与染液结合后，蓝色荧光增强，并且随着药物浓度的增加，细胞死亡的数量越来越多。

2.3?AO/PI双染

本试验通过牡丹乙酸乙酯提取物对MCF-7细胞生长作用的影响来评估提取物的抗癌活性。不

同浓度乙酸乙酯提取物作用于MCF-7细胞48、72 h 后的形态变化见图4，结果表明，对照组中激发出的绿色荧光区域较多，红色荧光则鲜有出现，表明细胞生长状态良好。与对照组比较，给药组中绿色荧光区域较少，并且变暗，而指示凋亡小体的红色荧光则愈发明显，随着给药时间的增加，红色荧光区域不断扩大，说明对MCF-7细胞进行给药治疗后，出现了细胞凋亡现象，且随着作用时间和药物浓度的增加，细胞凋亡现象愈加明显。

2.4?JC-1染色

不同浓度药物作用48 h后MCF-7细胞线粒体膜电位的变化情况见图5，可以明显观察到，同正常的细胞相比，给药组中的细胞随着药物浓度的增加，其荧光现象表现为红色荧光区域逐渐变少、变暗，而绿色荧光区域增多、变亮，说明细胞内的线粒体膜电位降低，JC-1没有聚集于线粒体基质内，因而被激发出绿色荧光，这种现象表明牡丹种皮提取物可以造成线粒体膜电位下降，诱导细胞产生凋亡，并且呈一定的剂量依赖性。

3?讨论与结论

本试验以牡丹榨油后的种皮为材料，采用乙酸乙酯溶剂对其进行提取。提取物作用于MCF-7细胞，之后通过AO/PI双染、Hoechst 33342染色、MTT法和JC-1染色等对MCF-7细胞的细胞形态、增殖抑制率、生长活力等进行分析研究。结果发现，乙酸乙酯提取物作用于MCF-7细胞后，细胞形态产生变化，形状变小，呈浑浊状态，部分细胞死亡;细胞抑制率随着药物质量浓度的增大和作用时间的延长而升高，在药物质量浓度为5 mg/mL，作用72 h后，细胞抑制率可达89.67%;细胞活力明显降低。试验结果表明，牡丹种皮乙酸乙酯提取物对MCF-7细胞的增殖作用有一定的抑制性，呈现出一定的剂量依赖性和时间依赖性，并且细胞线粒体膜电位也随着药物作用浓度的增加呈下降趋势，绿色荧光区域增多、变亮，而红色荧光区域逐渐变少、变暗，表明牡丹种皮乙酸乙酯提物可促使MCF-7细胞线粒体膜电位降低，诱导细胞产生凋亡。本研究为今后牡丹种皮的回收利用提供了一定的研究基础，可增强牡丹种皮的附加价值，符合循環经济发展的方向。

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