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高压静电场胁迫对甘草生长过程中RNA的影响

范文

李倩郭九峰高海荣

摘要：为探究高压静电场对甘草生长过程中RNA含量的影响，本试验以甘草幼叶、嫩茎和种子为研究材料，依次采用十二烷基苯磺酸钠（SDS）法、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法、异硫氰酸胍（Trizol）法提取甘草幼叶、嫩茎、种子的RNA，并进行比较分析。并通过紫外分光光度法，分析检测经不同强度高压静电场（0、12、15、18 kV）处理之后生长过程中甘草不同组织RNA含量。结果表明，3种方法均能从甘草中提取出RNA。SDS法是适用于甘草组织RNA提取的最佳方法。经不同强度高压静电场处理，甘草RNA含量增加，降解含量降低。高压静电场影响最明显的是处理电场强度为18 kV时，甘草生长9 d时，RNA含量最高。本研究初步探究了高压静电场对甘草生长过程中RNA含量的影响，为甘草RNA的研究和高压静电场与分子生物学的研究提供了基础参考。

关键词：甘草;高压静电场;RNA提取;SDS法;RNA含量

中图分类号：S567.7+10.1 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2020）13-0076-04

收稿日期：2019-08-10

基金项目：国家自然科学基金（编号：51467014）。

作者简介：李倩（1993—），女，河北张家口人，硕士，主要从事环境生物物理和分子技术研究。E-mail：934192500@qq.com。

通信作者：郭九峰，博士，教授，硕士生导师，主要从事生物物理与生物技术研究。E-mail：guojf101@sina.com。甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）作为我国传统的大宗中药材，本身也是一种可综合利用的经济型植物。但迄今为止，有关甘草不同组织总RNA的提取报道甚少。这主要是由于甘草叶片、茎干中蛋白质、脂肪、多糖等含量均很高，刺毛状腺体中还含有大量黏液质[1]。根和根茎中有甘草酸等丰富的次生代谢产物，致使提取甘草的RNA比一般的植物要困难，通过这些方法提取的RNA多适用于后期的逆转录PCR（PT-PCR）等试验，很少用于转录组测序[1-3]。针对这类植物，相关学者通过调整试验方式，结合不同方法以及加入不同的物质来提高植物RNA的提取率，例如陈华等使用改良Trizol法结合LiCl法提取了番茄叶片的RNA[4]。

高压静电技术是近几十年兴起的一种重要的处理种子的方法[5]。利用其能够击穿组织细胞壁和细胞膜的特征，从而提高种子的活化能，调节内部水分子、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）含量、酶活性等，优化原有性质，增强种子的生理生化反应[6-7]，提高种子活力，与此同时降低植物的发病率并提高其抗逆能力[8]。本试验以甘草幼叶、嫩茎、种子为材料，选用十二烷基苯磺酸钠（SDS）法、Trizol法、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取总RNA，期望找到一种提取甘草RNA的最佳方法，并能达到转录测序要求，并探究高压静电场对甘草RNA含量的影响，以便为后续相关分子水平研究提供科学参考。

1材料与方法

1.1材料及处理采集

1.1.1试剂材料甘草种子，选用人工栽培的乌拉尔甘草，购自内蒙古赤峰生态甘草种植基地;甘草完整苗株取自笔者所在课题组实验室组织培养的甘草苗。供试试剂：Trizol[天根生化科技（北京）有限公司]，CTAB、焦碳酸二乙酯（DEPC）、SDS、酚-三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、无RNA酶水（内蒙古鸿之惠商贸有限公司）。

1.1.2材料处理挑选饱满的甘草种子，于98%浓硫酸溶液中处理10 min，用无菌水洗涤3～4次，洗净种子表面残留酸液，晾干。将经浓硫酸处理过的种子分成若干份，进行高压静电场处理。高压静电场电压的选取是在笔者所在课题组研究基础上进行筛选的，电压依次为0（CK）、12、15、18 kV，处理时间为 25 min（CK处理为0 min）。高压静电场处理完之后，置于10%次氯酸钠溶液中15 min，用无菌水洗涤数次，晾干备用。播种于MS培养基中

表明提取的总RNA完整性好。CTAB法得到的凝胶电泳图谱中，幼叶的整体效果不错，但嫩茎的条带有些许弥散，可能是DNA污染造成的;种子的条带完整但亮度偏暗，可能是沉降过程不完全所致，或有其他物质轻微干扰所致。Trizol法提取甘草幼叶、嫩茎和种子总RNA过程中，出现溶液褐化现象，幼叶的最终提取产物中稍有影响，但整体影响不大。而嫩茎和种子中RNA存在量微乎其微，整体完整性略低，质量差。因此，通过3种方法分析比较，SDS法是提取甘草RNA的最佳方法。

2.2SDS法提取不同高压静电场处理甘草苗的RNA检测

采用SDS法提取经由不同高压静电场处理的甘草苗的RNA，电泳结果见图4，条带清晰、明亮。18 kV和CK条件下（泳道3和泳道4）条带孔位有些明亮，考虑可能有沉淀未洗脱完全。经电场处理的泳道条带比CK清晰明亮，说明经高压静电场处理对甘草RNA的提取起到了一定的促进作用。

2.3SDS法的PCR验证

采用SDS法得到的不同高壓静电场处理的甘幼叶、嫩茎和种子RNA进行逆转录反应，以RT-PCR得到的第一链CDNA作为模板，以甘草Actin基因设计引物对，进行PCR扩增，结果见图5。不同高压静电场处理的甘草的幼叶、嫩茎和种子都出现了目的条带，扩增效果理想，条带清晰明显，没有一点拖带，进一步说明SDS法是甘草RNA提取的最佳方法，同时高压静电场的加入也优化了高质量RNA的获得。

2.4RNA含量与电场强度的关系

使用SDS法提取甘草种子经电场处理和对照组分别生长1、3、5、7、9、11 d的RNA，检测不同高压静电场对甘草RNA的影响（图6）。

不同高压静电场处理在不同生长时间里，RNA含量呈现不同的变化趋势。随着生长时间的延长，经高压静电场处理的RNA含量出现不同程度的波动变化，在15、18 kV条件下整体波动上升，12 kV条件下，在一定范围之内波动下降，而CK组出现大范围波动下降。随着电场强度增加，RNA的含量也出现波动变化，综合观察来看，当处理所用高压静电场强度为18 kV时，甘草生长到9 d时，RNA含量最大，并且此时RNA降解量最少。因此，确定 18 kV 为最佳电场强度。

3讨论与结论

纯度高、完整性好的RNA是进行RT-PCR、荧光定量Real-time PCR、转录组测序、基因表达分析等的基础[22-23]。甘草是一种经济型综合利用的植物，由于其本身有大量蛋白质、多糖，茎叶的刺毛状腺体中还含有大量黏液质，根和根茎中又有丰富的

次生代谢产物，提取甘草RNA面临一定的困难。Trizol法是一种简单快速提取RNA的方法，试验中溶液褐化现象，可能与试剂中含有氧化性物质有关，在去除杂质的同时也会造成RNA的损失，所以Trizol法不适合甘草这类植物RNA的提取。CTAB法能够摒弃试验过程中的部分氧化还原情况，但是其操作复杂，操作过程温度区间涉及广，容易造成降解。因此，并不是提取甘草RNA的最佳方法。SDS法既能克服Trizol法的一些弊端，又比CTAB法操作简单，且成本不高，能够获得高质量的RNA。因此，SDS法是甘草不同组织RNA提取的最佳选择。高压静电场是近几十年来兴起的且用途广泛的一门技术[5]，本试验通过加入高压静电场的处理，结果表明，甘草组织中RNA的获得率确有提高，说明高压静电场处理促进了RNA的提取。目前为止，有关电场对植物的处理效应详尽的机制尚未有明确的定论，可能的分析方向类型有细胞膜电穿孔模型、电崩解模型、影响酶的活性[24-27]、影响遗传物质[28-29]等。本研究结果表明，高压静电场处理甘草之后，组织中RNA发生了明显的变化，这也验证了高压静电场影响遗传物质的说法。

本试验研究了不同RNA提取方法对甘草的适用性，并以此为基础探究高压静电场处理对甘草生长过程中RNA含量的影响。存在于自然界的所有生物体都拥有特异的生理特性和电磁效应，试验證明，高压静电场处理对甘草RNA的提取有促进作用，这可能也为高质量RNA的获得提供一种可能。想要全面、深层次地探究高压静电场对甘草RNA的影响机制，未来学者可以以此为切入点从不同层次进行探究。

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