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三孢布拉氏霉菌发酵产番茄红素工艺条件的优化

范文

刘春芬慕金超

摘要：利用三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素，并对其发酵条件进行探讨，确定其最佳发酵条件。结果表明，番茄红素最大吸收波长为508 nm;活化的冻干粉菌种在斜面培养基上于25 ℃培养5 d后，呈较好生长状态，菌丝粗壮，孢子生长状态饱满，镜检显示，其个体生长状态良好;扩大培养120 h时孢子数量达到最高峰;发酵至36 h时添加阻断剂效果最好，发酵至72 h时添加增氧剂效果最好。通过发酵条件优化的正交试验发现，三孢布拉氏霉菌发酵产番茄红素的最优发酵工艺为发酵温度25 ℃、pH值5.0、发酵时间5 d、接种量10.0%。

关键词：番茄红素;三孢布拉氏霉菌;发酵;工艺条件

中图分类号： TQ920.6;S182? 文献标志码： A? 文章编号：1002-1302（2020）20-0214-04

番茄红素主要存在于植物细胞的有色体中，因具有抗癌、降低心血管疾病发病率、预防动脉粥样硬化、提高免疫力等生理功能，国内外对其研究热度逐年递增，目前国内外生产番茄红素的方法有以下几种：有机溶剂提取法、超临界萃取法、化学合成法等，利用这些方法合成的番茄红素存在化学物残留问题，品质不高。采用生物合成中的微生物合成法，利用三孢布拉氏霉菌发酵产出番茄红素，和其他的方法相比，具有不受季节控制、操作工艺简单、用时短、生产成本较为低廉等优势。另外相对其他几种方法来说，生物合成法可以获得较高的番茄红素得率，是生产番茄红素的一种理想途径。

本试验研究利用生物发酵法生产番茄红素时发酵条件、培养基成分、各类抑制剂等对成品产量及品质的影响，并对工艺进行优化，初步建立通过微生物发酵生物合成番茄红素的基本工艺。

1 试验材料

1.1 试验时间及地点

试验于2019年6—10月进行，试验地点为学院微生物实训中心。

1.2 材料及试剂

GM3.560三孢布拉氏霉（中国微生物菌种保藏中心，编号：ATCC 14059）;玉米粉、玉米淀粉（在超市或农贸市场购买）;番茄红素标准品（CAS：502-65-8，有效成分含量>98%，规格：20 mg/支）;可溶性淀粉、硫酸镁、磷酸二氢钾、淀粉均为分析纯;琼脂、维生素B1、酵母膏为生化試剂。

1.3 培养基

活化用培养基：磷酸二氢钾1 g、七水硫酸镁 0.5 g、可溶性淀粉15 g、酵母膏4.0 g，溶于 1 000 mL 蒸馏水中，加入琼脂15 g，充分溶解。121 ℃ 灭菌20 min，制备斜面。

扩大培养用培养基：除不添加琼脂外，其他成分同活化用培养基。

发酵培养基：玉米粉40 g、淀粉糖化液40 g、可溶性淀粉50 g、磷酸二氢钾0.5 g、七水硫酸镁 0.25 g、维生素B1少量，溶于1 L蒸馏水中，加热至完全溶解，调节pH值为6.5，分装在10个锥形瓶中标号1～10，冷却备用。

2 试验方法

ATCC 14059→活化→扩大培养→计孢子数→接种至发酵培养基中→发酵→添加阻断剂和增氧剂→发酵条件的优化→发酵醪→过滤→滤液→减压浓缩→成品

2.1 番茄红素最大吸收波长的确定

对番茄红素标准品在480～520 nm范围内进行最大吸收波长的扫描[1-3]，找到番茄红素标准品最大吸收峰，由此确定番茄红素的最大吸收波长。

2.2 番茄红素标准线性范围的确定

取20 mg番茄红素标准品置于50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，将其作为储备液。用移液管移取1 mL储备液置于50 mL容量瓶中，同样用乙酸乙酯定容至刻度，作为标准使用液。分别吸取标准使用液0.00、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mL 置于 25 mL 容量瓶中，并用乙酸乙酯定容至刻度，然后于最大吸收波长处分别测定其吸光度，绘制标准曲线。

2.3 菌种的活化及扩大培养

将0.1 mL无菌生理盐水加入到冻干菌粉的安瓿瓶中，振荡成悬浮状，吸取全部菌体悬浮液，移至4支斜面培养基上，在25 ℃培养5～7 d[4-7]。将活化后的菌种接种到扩大培养用培养基中，在25 ℃振荡培养，转速为150 r/min。自培养48 h开始每隔24 h取菌液计数，当培养基中孢子数达109～1010个/mL 时，停止培养，此培养液备用。

2.4 发酵培养

向发酵培养基中接种10%种子液，摇匀，在 25 ℃ 振荡培养，转速为150 r/min[8]。

2.5 阻断剂及增氧剂添加时间的确定

选用烟草废弃物作为阻断剂，在发酵培养24、30、36、42、48 h时分别向1～5号瓶中加入阻断剂007 g，均进行5 d发酵培养。过滤发酵液，弃去滤渣，将滤液减压浓缩，分析确定阻断剂添加时间。以不添加阻断剂为空白对照。

分别在发酵培养的48、60、72、84、96 h时向6～10号瓶中各加入增氧剂30% H2O2 0.5 g，均进行 5 d 发酵培养，分析确定增氧剂最佳添加时间。以不添加增氧剂为空白对照。

2.6 发酵条件的优化

探讨温度（20、25、30 ℃）、pH值（4.5、5.0、55）、发酵时间（4、5、6 d）、接种量（7.5%、10.0%、125%）等因素[9-14]对发酵结果的影响，分析确定采用三孢布拉氏霉菌发酵生产番茄红素的最佳条件。

3 结果与分析

3.1 番茄红素最大吸收波长的确定

如图1所示，番茄红素标准品在508 nm处有最大吸收峰，因此番茄红素的最大吸收波长为508 nm。

3.2 番茄红素标准工作曲线的绘制

采用分光光度计在波长为508 nm处测定标准系列溶液的吸光度，得到如图2所示结果。

3.3 菌种的活化培养

在斜面培养基上于25 ℃培养5 d后的冻干粉菌种呈较好的生长状态，菌丝粗壯，孢子生长状态饱满。图3显示，该菌菌丝非常粗壮且长度较大，菌丝无横膈膜，属于单细胞，具有多个细胞核，未发现假根。

3.4 种子的扩大培养时间

从表1可以看出，从培养48 h开始，随着培养时间的延长，孢子数呈对数递增趋势，到培养120 h时，孢子数量达到最高峰，随后再延长培养时间，孢子数量没有明显的增加，说明此时扩大培养基中营养成分已经较少，代谢产物积累较多，菌体开始由对数生长期转向稳定生长期，新生细胞数与死亡细胞数保持动态平衡，孢子数量出现减少趋势，可以推论，此后霉菌将进入衰亡期，因此，选择在培养120 h时终止培养，得到种子培养液。

3.5 阻断剂添加时间的确定

在508 nm处分别测定减压浓缩后滤液的吸光度[15]，由于测得的吸光度过大，不在番茄红素标准工作曲线的线性范围内，因此测定之前分别将5瓶发酵液稀释2倍，得到图4所示结果。空白对照组发酵5 d后，经测定吸光度为0.295。由图4可见，比较试验组的吸光度与对照组发现，发酵过程中添加阻断剂能有效阻断胡萝卜素的生成，从而使得产物仍为番茄红素。当发酵进行至36 h时添加阻断剂效果最好，因此，选择添加时间为发酵 36 h 时。

3.6 增氧剂添加时间的确定

在508 nm处分别测定减压浓缩后滤液的吸光度，由于测得吸光度过大，不在番茄红素标准工作曲线的线性范围内，因此测定之前分别将5瓶发酵液稀释2倍，得到图5所示结果。空白对照组发酵5 d后，经测定吸光度值为0.287。由图5可见，比较试验组的吸光度与对照组发现，发酵过程中添加增氧剂能有效增加番茄红素的生成量。当发酵进行至72 h时添加增氧剂效果最好，因此，选择添加时间为发酵72 h时。

3.7 发酵条件的优化

3.7.1 发酵温度的确定由图6可知，在一定范围内当发酵温度升高时，番茄红素的浓度也随之增加;当温度上升到25 ℃时，番茄红素的浓度达到最高值;如果温度继续升高，番茄红素的浓度反而下降，这是因为三孢布拉氏霉菌的最适发酵温度为 25～28 ℃，因此选择25 ℃为其发酵最佳温度。

3.7.2 发酵液pH值的确定由图7可知，当发酵液pH值上升至5时，番茄红素的浓度达到最高值;继续升高pH值，番茄红素的浓度反而下降，说明三孢布拉氏霉菌的最适发酵pH值在5左右。

3.7.3 发酵时间的确定由图8可知，当发酵进行至5 d时，番茄红素含量达到最大值，其后，随着时间的延长，产物含量不增反降，可能是由于番茄红素本身不稳定，发生了部分分解，因此，选择最佳发酵时间为5 d。

3.7.4 接种量的确定由图9可知，在一定范围内番茄红素产量随着接种量增加逐渐递增，当接种量增加到10%时，番茄红素产量达到最大，其后随着接种量的持续增加，番茄红素产量没有明显变化，从经济角度考虑，选择接种量为10%。

3.7.5 发酵条件优化的正交试验结果由于测得吸光度不在番茄红素标准工作曲线的线性范围内，因此测定之前分别稀释2倍，得到表2所示结果。由正交试验结果可知，影响三孢布拉氏霉菌发酵产番茄红素各因素的主次顺序是C>A>B>D，即发酵时间>发酵温度>pH值>接种量。由k值可得，最佳组合方案为A2B2C2D2，即发酵温度25 ℃、培养基pH值5.0、发酵时间5 d、接种量10.0%。

因为最佳组合方案没有在9组正交试验中出现，所以根据正交试验所得到的最佳条件因素做验证试验。经过试验测定得出，在最佳组合方案下吸光度为1.121，对照标准曲线计算得到的番茄红素浓度为 17.61 μg/mL，比正交试验4号的 15.93 μg/mL 大。结果表明，发酵温度25 ℃、培养基pH值5.0、发酵时间5 d、接种量10.0%是发酵最佳工艺参数。

4 结论

本试验确定了番茄红素的最大吸收波长为 508 nm;活化的冻干粉菌种在斜面培养基上于25 ℃培养5 d后，呈较好的生长状态，菌丝粗壮，孢子生长状态饱满，镜检显示，其个体生长状态良好;扩大培养120 h时孢子数量达到最高峰;当发酵进行至36 h时添加阻断剂效果最好，发酵进行至 72 h 时添加增氧剂效果最好;通过发酵条件优化的正交试验发现，三孢布拉氏霉菌发酵产番茄红素的最佳发酵条件为发酵温度25 ℃、培养基pH值5.0、发酵时间5 d、接种量10.0%。

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