| 标题 | 自然环境下根表铁膜对空心菜吸收抗生素的影响与调控 |
| 范文 | 王睿哲+唐俊 摘要：通过在营养液中投加不同浓度（0-20mg/L）Fe2+形成根表铁膜，探讨抗生素植物富集作用及根表铁膜对植物吸收抗生素的影响与效果。结果表明，沙星类和四环素类抗生素植物富集作用明显，根部富集强力霉素能力最大（浓度达660.03mg/kg），地上部分富集环丙沙星能力最高（9.31mg/kg）；Fe2+诱导空心菜根表形成铁膜可以有效降低根部富集抗生素浓度（降低率达26.56%-84.15%）和地上部位富集抗生素浓度（29.03%-67.38%），且铁膜对磺胺类抗生素富集阻滞作用最明显。 关键词：根表铁膜；抗生素；空心菜；富集；抑制 中图分类号：V216.5+1 文献标识码：A 文章编号：2095-672X（2017）04-0119-04 DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.04.056 Abstract： The effects of antibiotic plant enrichment and root iron membrane on plant uptake of antibiotics were studied by adding different concentrations （0-20mg / L） Fe2 + to form root iron membrane. The results showed that the enrichment effect of tetracycline and tetracycline antibiotics was obvious， and the ability of enrichment of doxycycline was the highest （concentration 660.03mg / kg）， and the highest enrichment of ciprofloxacin （9.31mg / kg） （29.03% -67.38%） and the enrichment of antibiotic concentration （29.03% -67.38%） on the aerial parts of the aerial surface， and the iron film was enriched with sulfonamides， and the concentration of antibiotics was reduced Blocking the most obvious effect. Key words：Root surface iron film； Antibiotics； Spinach； Enrichment； Inhibition 我国是全球抗生素的生产和使用大国，每年生产抗生素原料超过21万t，人均年消费量是美国人的10倍。由于抗生素难以被动物肠胃吸收，约30%-90%以母体化合物的形式随粪便排出进入环境中（Chee-Sanford et al.， 2009），由此导致的抗生素污染[1]及其生态毒理效应已成为我国乃至全球所面临的重大环境问题之一（李伟明等， 2012）。抗生素在引起水体环境污染的同时，其在水生植物体内迁移与富集逐渐引起人们重视。廖杰等（2015）采用养猪场废水培养水芹，发现四环素等抗生素冬季在水芹叶部富集能力最高达到7.33mg/kg；王瑾等（2008）在长期施用规模养殖场猪粪的土壤[2]中种植韭菜后，在其根部检测出土霉素及金霉素，说明抗生素植物富集能力较高，易通过食物链危害人体健康。 空心菜（拉丁文名：Ipomoea aquatic Forsk），是番薯属光萼组植物，原产中国，现已作为一种蔬菜广泛栽培。空心菜是一类既可生活于旱地又可生活于水田的水陆两栖性植物，但还是水分较多时生长旺盛，最适宜在肥水田或畜舍附近的经常排粪水的田中种植。因此空心菜对水中残留抗生素，特别是养殖场排放的粪水中高浓度抗生素的富集问题日益引起社会关注。 水生植物的根系作为外界污染物进入植物体内的主要通道，其表面广泛存在的铁膜，对植物吸收养分和污染物起着重要的门户作用（刘文菊， 2005）。根表铁膜是植物为适应淹水环境，根系生成大量通气组织，将大气中的氧气通过叶片输送到根系，改变根际环境，形成大量还原性物质，如Fe2+，使其在根表沉积形成铁氧化胶膜（刘春英，2014）。根表铁膜可对重金属元素的吸收与运输起到阻碍作用，如红树林根表铁膜可将镉截留在根表（Du et al.， 2013），水稻根表铁膜可以对Sb产生截留作用（黄艳超，2015），与As发生吸附和共沉淀作用而降低水稻等作物根系吸收As的量 （胡莹，2013）。另外，铁膜的氧化作用可将As3+转化成毒性较小的As5+，从而使得植物获得去除砷毒害的能力（Otte et al.， 1991）。 现有针对根表铁膜对植物吸收有机污染物的研究报道较少，马微等（2015）研究表明，随着诺氟沙星浓度增加根表铁膜量逐渐减少，但铁膜富集的诺氟沙星含量远超过根內及地上部分含量。综合以上研究可见，根表铁膜对诺氟沙星这类两性化合物具有较强的吸附作用，诺氟沙星在一定程度上抑制了根表铁膜的形成，而铁膜对抗生素植物富集的影响尚未明确，现有研究多集中于铁膜氧化性对金属价态的影响，而关于根际微域氧化性[3]对有机污染物代谢转化作用的报道甚少。 为此，本项目拟选取空心菜为供试材料，通过室内水培实验，利用添加Fe2+诱导根表形成铁膜，研究根表铁膜对磺胺类抗生素（磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲嘧啶）、氟喹诺酮类抗生素（环丙沙星、氧氟沙星）和四环素类抗生素（强力霉素、四环素、土霉素）植物富集的影响，以期为抗生素在水生蔬菜体内富集调控提供参考依据。 1 材料与方法 1.1 仪器设备 Xevo TQ MS超高效液相色谱-串联质谱仪：美国Waters公司； 固相萃取装置：十二孔，美国Supelco公司； 超声波清洗器：KQ-5200型，昆山市超声仪器有限公司； 氮吹仪：N-EVAPTM 112，Organomation Associates， Jnc； pH计：PHS-3C 型，上海精密科学仪器有限公司； 电子天平：FA2104A型，上海精天仪器有限公司。 1.2 试剂及材料 磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole，SMZ）、磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine，SM2）、氧氟沙星（Ofloxacin， OFX）、环丙沙星（Ciprofloxacin， CIP），纯度≥99%，Sigma公司； 四环素（Tetracycline，TC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC）、强力霉素（Doxycycline， DOC）标准品，纯度≥95%，BIO BASIC INC公司； 乙二胺四乙酸二钠，优级纯，国药化工有限公司； 甲醇，色谱纯，天津市四友精细化工有限公司； 甲酸，优级纯，天津市四友精细化工有限公司； Oasis HLB固相萃取小柱 （200mg/6mL ），美国Waters公司； 实验用水为超纯水。 1.3 空心菜培养 选用空心菜（Ipomoea aquatica）饱满的种子，用纯水浸泡10h，再用1%次氯酸钠溶液浸泡消毒20min，纯水洗涤5次。将种子置于蛭石中放在培养箱中催芽（20℃，黑暗），期间保持蛭石湿润。待空心菜发芽后移至模拟光源条件下培养，待株高长至10厘米左右时，将其移植进行营养液培养。 选择长势相似一致的空心菜苗，移植入黑色聚丙烯培养罐（内装1.0L霍格兰营养液）中，毎罐用苗3株，罐盖中心开直径1cm左右小孔，用海绵固定菜苗，使其根部浸入营养液中。 1.4 空心菜根表铁膜的培养 向营养液中加入不同体积1000mg/L的EDTA-Fe溶液并调节pH至5.5，设置CK、A、B、C、D5个处理组，使Fe2+在每个处理组营养液中浓度分别为0、1、5、10和20mg/L，每组设3个平行样。菜苗在20℃下培养5天，每天光照时间16h，期间每天向罐中补充营养液至原体积。 1.5 抗生素暴露实验 待根表形成铁膜[4]（根表颜色变成暗红）后，将原营养液弃去，重新向培养罐中加入1.0L新鲜并且不含Fe2+的霍格兰营养液（pH5.5），然后加入8种1000mg/L抗生素混合标样（甲醇溶解）1.0mL，使各种抗生素浓度达到1.0mg/L，连续培养一周。 1.6 样品前处理 暴露实验一周后，将空心菜移出培养罐，纯水洗涤根部3次后用DCB提取法（马微， 2015）去除根表铁膜及其吸附的抗生素，然后将地上部分与地下部分分开，经冷冻干燥48h后高速粉碎，过100目筛。 1.7 抗生素提取 参考赵慧兰（2014）的方法：称取0.2g粉碎的样品于15mL聚丙烯离心管重，加入0.2g乙二胺四乙酸二钠和pH3.0磷酸盐缓冲液、乙腈各5.0mL，机械振荡10min再超声波提取10min，4000rpm离心5min，上清液移至另一50mL离心管中，再加入pH3.0磷酸盐缓冲液、乙腈各5.0mL重复提取两次。合并提取液，取15mL提取液过0.45?m 滤膜以除去悬浮物[5]，滤液加入到200mL纯水中，用甲酸调节pH至3.0，过Oasis HLB固相萃取小柱净化。 HLB小柱上样之前依次用6.0mL甲醇、6.0mL超纯水和6.0mL pH3磷酸盐缓冲液预淋，然后水样以5-8mL/min流速通过HLB小柱。样品过柱后，用10mL纯水洗涤小柱，然后在氮气保护下真空抽滤干燥20min，然后用10.0 mL甲醇洗脱，洗脱液在40℃下用氮气吹干，加入1.0 mL 50%甲醇水溶液并超声助溶，过0.22?m滤膜，待测定。 1.8 抗生素的测定 1.8.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC? BEH C18，1.7μm，2.1mm×100mm；流速[6]：0.15mL/min；进样量：10μL；流动相：A： 2/98=甲醇/水（V/V）+0.1%甲酸 B：甲醇+0.1%甲酸，流动相采用梯度洗脱，具体如表1所示。 1.8.2 质谱条件 电离方式：ESI+； 毛细管电压：3kv；离子源温度：150℃；锥孔反吹气流量：50L/Hr；脱溶剂气温度：400℃；脱溶剂气流量：800L/Hr；监测模式：MRM模式，离子监测条件（表2）。 1.8.3 标准曲线配制与方法验证 配制10-500?g/L抗生素混合标样，在上述添加下测定其峰面积，利用峰面积[7]和濃度绘制标准曲线。同时在空白空心菜茎叶和根样品中添加50?g/kg抗生素混标并重复三次以验证方法的准确度和灵敏度，利用S/N=10计算方法的最低检测浓度（LOQ）。 2 结果与分析 2.1 方法准确度与精密度 8种抗生素的标准曲线如表3所示，多级反应监测（MRM）模式总离子流图见图1。由表3可见，待测种目标抗生素在10-500?g/L浓度范围内线性关系良好，决定系数R2>0.99，8种抗生素添加回收率在78%-95%，RSD<10%，最小检测浓度为检测限介于0.83?g/kg和12.58?g/kg之间，能够满足样品中抗生素[8]测定的要求。 2.2 根表铁膜对空心菜根部抗生素富集的影响 空心菜根部富集8种抗生素的结果见表4。由表4中CK（对照）组可见，空心菜根部富集抗生素的能力较强，其中沙星类和四环素类富集浓度均超过100mg/kg，强力霉素富集能力最大，富集系数达660.03。同时，投加不同浓度Fe2+形成根表铁膜后，根部富集的抗生素浓度都明显下降，较对照组而言浓度降低率可达26.56%-84.15%。从铁膜对不同类型抗生素富集阻滞作用来看，铁膜对磺胺类抗生素的作用最明显（降低率64.91%-84.15%），其次是沙星类抗生素（降低率51.54%-61.78%），对四环素类抗生素富集阻滞作用较弱（降低率26.56%-46.87%）。 2.3 根表铁膜对空心菜地上部位抗生素富集的影响 8种抗生素在空心菜地上部分（茎叶）中富集浓度见表5。CK（对照）组营养液中没有添加Fe2+形成根表铁膜，空心菜茎叶中各种抗生素含量均明显高于其它处理组。对照组茎叶中磺胺嘧啶浓度最低（0.48mg/kg），环丙沙星最高（9.31 mg/kg），说明沙星类抗生素在空心菜茎叶部位最容易富集，其次是四环素类，磺胺类抗生素富集能力最低，这可能与抗生素自身的物理化学特性有关。通过向营养液中加入1-20mg/L Fe2+，空心菜根表形成不同量铁膜[9]对其地上部分富集抗生素具有明显的阻滞作用，其中添加5mg/L Fe2+的处理组（B）茎叶中抗生素浓度相对其它组而言是最低的，8种抗生素富集浓度降低率可达29.03%-67.38%。 3 讨论 本实验中，沙星类和四环素类抗生素在空心菜体内富集能力较强，两类抗生素富集浓度之和为26.59mg/kg，这与廖杰（2015）得出夏季沙星类和四环素类抗生素在空心菜体内浓度达到22.89-103.7mg/kg的研究结果基本一致，说明这两类抗生素在空心菜体内富集能力强，水中抗生素容易通过食物链进入人体。马薇（2015）研究表明水稻根表铁膜在土培条件下可以很好抑制根系对诺氟沙星和土霉素[10]的富集，而水培条件下效果不明显。 本研究中，投加Fe2+在空心菜根表形成铁膜后，可以有效降低根部富集抗生素浓度（降低26.56%-84.15%）和地上部位富集抗生素[11]浓度（降低29.03%-67.38%），且铁膜对磺胺类抗生素富集抑制作用最明显，说明空心菜根表铁膜对抗生素的富集抑制效果较水稻明显，可以更好的发挥对抗生素类污染物的富集调控作用。通过不同浓度Fe2+的实际抑制效果分析，5mg/L 的Fe2+在根表形成的铁膜更有利于调控空心菜根系对抗生素的富集，这主要与Fe2+对空心菜的营养生长的影响有关，培养液中加入高浓度Fe2+更有利于诱导根表形成铁膜，但空心菜生长会受到不利影响，表现为生物量的下降根系发育的不良，因此会造成富集浓度放大的效应，而低浓度的Fe2+诱导生成的铁膜量有限，不足以承担抗生素“富集库”或者“屏障”作用，因而限制其发挥对抗生素的富集抑制作用。本实验关于浓度为5mg/L 的Fe2+在根表形成的铁膜更有利于调控空心菜根系对抗生素[12]富集的结果可供参考，关于空心菜根表铁膜培养及其培养液筛选等有待于更进一步的研究。 4 结论 本研究结果表明，空心菜对沙星类和四环素类抗生素富集作用明显，而加入Fe2+诱导根表形成铁膜后，可以较好发挥其对根系吸收抗生素的抑制作用；培养液中Fe2+量为5mg/L时效果最为明显，有利于调控空心菜对水中抗生素的富集。 参考文献 [1]Chee-Sanford， J. C.， Mackie， R. I.， Koike， S.， Krapac， I. G.， Lin， Y. F.，Yannarell，A. C.， Maxwell， S.， Aminov， R. I.， Fate and transport of antibiotic residues and antibiotic resistance genes following land application of manure waste[J]. J Environ Qual. 2009，38（3）： 1086-1108. [2]Du， J.， Yan， C.， Li， Z.， Formation of iron plaque on mangrove Kandalar. Obovata （S.L.） root surfaces and its role in cadmium uptake and translocation[J]. Mar Pollut Bull. 2013，74（1）： 105-109. [3]Otte， M. L.， Dekkers， M. J.， Rozema， J.， Broekman， R. A.， Uptake of arsenic by Aster tripolium in relation to rhizosphere oxidation[J]. Canada Journal of Botany. 1991，（69）： 2670-2677. [4]黃艳超，胡莹，刘云霞，黄益宗，武雪芳.苗期水稻吸收、转运Sb（V）的研究[J].江苏农业科学，2015，43（10）：68-70. [5]胡莹，黄益宗，黄艳超，刘云霞.根表铁锰膜对不同生育期水稻吸收和转运As 的影响[J]. 生态毒理学报，2013，8（02）：163-171. [6]刘春英，陈春丽，弓晓峰，周文斌，杨菊云.湿地植物根表铁膜研究进展[J].生态学报，2014，34（10）：2470-2480. [7]李伟明，鲍艳宇，周启星，四环素类抗生素降解途径及其主要降解产物研究进展[J].应用生态学报，2012，23（8）：2300-2308. [8]廖杰，徐熙安，刘玉洪，李瑞兴，刘琳，刘超翔.水生植物滤床深度处理养殖废水过程中抗生素与抗性基因的响应研究[J].环境科学学报，2015，5（8）：2464-2470. [9]刘文菊，朱永官，2005.湿地植物根表的铁锰氧化物膜[J].生态学报.25（2）：358-363. [10]马微，鲍艳宇.根表铁氧化物胶膜对水稻吸收诺氟沙星的影响[J].环境科学，2015，36（6）： 2259-2265. [11]王瑾，韩剑众.饲料中重金属和抗生素对土壤和蔬菜的影响[J].生态与农村环境学报，2008，24（4）：90-93. [12]赵慧兰.集约化蔬菜种植区土壤中喹诺酮类抗生素的残留动态及其健康风险 [D].济南：山东大学硕士论文，2014（10）：21-25. 作者简介：唐俊（1981-），男，硕士，安徽农业大学资源与环境学院副教授，研究领域为环境污染物监测与评价、水污染控制技术。 |
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